(19) 대한민국특허청(KR)
(12) 등록특허공보(B1)
(45) 공고일자 2017년02월06일
(11) 등록번호 10-1703299
(24) 등록일자 2017년01월31일
(51) 국제특허분류(Int. Cl.)
A01K 67/027 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01)
(52) CPC특허분류
A01K 67/0275 (2013.01)
A61K 39/395 (2013.01)
(21) 출원번호 10-2015-7022196(분할)
(22) 출원일자(국제) 2008년05월30일
심사청구일자 2015년08월17일
(85) 번역문제출일자 2015년08월17일
(65) 공개번호 10-2015-0101475
(43) 공개일자 2015년09월03일
(62) 원출원 특허 10-2009-7024974
원출원일자(국제) 2008년05월30일
심사청구일자 2013년05월27일
(86) 국제출원번호 PCT/US2008/065419
(87) 국제공개번호 WO 2008/151081
국제공개일자 2008년12월11일
(30) 우선권주장
60/914,619 2007년06월01일 미국(US)
60/044,324 2008년04월11일 미국(US)
(56) 선행기술조사문헌
US20060117398 A1*
WO2007060495 A1
PNAS vol 103(41), pp. 15130-15135(2006)
Nucleic Acids Res. 2003 Jun 1; 31(11):
2952-2962.
*는 심사관에 의하여 인용된 문헌
(73) 특허권자
오픈 모노클로날 테크놀로지, 인코포레이티드
미국 94303 캘리포니아주 팔로 알토 스위트 에이
로스 로드 2747
(72) 발명자
뷔로 로날드
미국 94303 캘리포니아주 팔로 알토 로스 로드
2724
(74) 대리인
특허법인코리아나
전체 청구항 수 : 총 21 항 심사관 : 박영관
(54) 발명의 명칭 내생적 면역글로불린 유전자를 억제하고 트랜스제닉 인간 이디오타입 항체를 생산하기 위한
방법 및 조성물
(57) 요 약
본 발명은 내생적 Ig 가 결핍되어 있고 트랜스제닉 항체를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물, 및 이의 생산 방법
에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 동물에서 트랜스제닉 항체를 생산하는 방법, 및 이렇게 생산된 트랜
스제닉 항체에 관한 것이다.
대 표 도
등록특허 10-1703299
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(52) CPC특허분류
C07K 16/00 (2013.01)
C12N 15/8775 (2013.01)
A01K 2227/105 (2013.01)
A01K 2267/01 (2013.01)
C07K 2317/24 (2013.01)
등록특허 10-1703299
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명 세 서
청구범위
청구항 1
(i) 래트 생식 세포, 래트 수정된 난모 세포 또는 래트 배아내로 래트에 내생적 중쇄 유전자자리, 내생적 경쇄
유전자자리, 또는 양자 모두 내의 Ig 유전자 단편에 대해 특이적인 메가뉴클레아제를 주입하는 단계로서, 상기
메가뉴클레아제가 상기 중쇄 유전자 자리, 경쇄 유전자자리, 또는 양자 모두 내로 이중-가닥 절단을 도입하는
단계; 또는 (ii) 래트 생식 세포, 래트 수정된 난모 세포 또는 래트 배아내로 래트에 내생적 중쇄 유전자자리,
내생적 경쇄 유전자자리, 또는 양자 모두 내의 Ig 유전자 단편에 대해 특이적인 메가뉴클레아제를 인코딩하는
핵산 또는 발현 벡터를 도입하는 단계로서, 상기 메가뉴클레아제가 상기 중쇄 유전자 자리, 경쇄 유전자자리,
또는 양자 모두 내로 이중-가닥 절단을 도입하는 단계를 포함하는 래트의 번식 방법.
청구항 2
제 1 항의 방법에 의해 번식된, 내생적 Ig 경쇄 유전자자리, 내생적 Ig 중쇄 유전자자리, 또는 양자 모두에서
무접합형 (nullizygous)인 래트.
청구항 3
제 2 항에 있어서, 인공 Ig 유전자자리를 포함하는 래트.
청구항 4
제 3 항에 있어서, 인공 Ig 유전자자리가 Ig 경쇄 유전자자리, Ig 중쇄 유전자자리 또는 양자 모두인 래트.
청구항 5
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 인공 Ig 유전자자리가 다수의 면역글로불린 유전자 분절을 포함하는 인간 및
래트 Ig 유전자자리의 분절을 포함하는 Ig 유전자자리를 포함하는 것인 래트.
청구항 6
제 5 항에 있어서, (i) 하나 이상의 V (Variable) 유전자 분절이 인간 V 유전자 분절이거나; (ii) 하나 이상의
D (diverse) 유전자 분절이 인간 D 유전자 분절이거나; 또는 양자 모두인 래트.
청구항 7
제 5 항에 있어서, 인간 유전자 분절이 하기 (i) 내지 (iii)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서
열을 포함하는 래트:
(i) 인간 Ig 유전자 분절의 천연 발생 서열; (ii) 인간 Ig 유전자 분절의 천연 발생 서열의 변성형; 및 (iii)
인간 Ig 유전자 분절의 천연 발생 서열로 인코딩된 폴리펩티드와 85% 내지 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 인코
딩하는 합성 서열.
청구항 8
제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 인간 이디오타입 면역글로불린을 생산할 수 있는 래트.
청구항 9
(i) 제 3 항의 래트를 면역원으로 면역화시키는 단계; (ii) 래트로부터 단일클론 항체 생성 세포를 단리하는 단
계로서, 상기 단일클론 항체 생성 세포는 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 것인 단계;
및 (iii) 상기 단일클론 항체 생성 세포를 사용하여 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를
생산하거나, 또는 상기 단일클론 항체 생성 세포를 이용하여 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 생
산하고, 상기 하이브리도마 세포를 이용하여 단일클론 항체를 생산하는 단계
등록특허 10-1703299
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를 포함하는 단일클론 항체를 생산하는 방법.
청구항 10
제 9 항에 있어서, (i) 항체를 정제하는 단계; 및 (ii) 항체를 환자에 투여하기에 적합한 적절한 약제학적 담체
와 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
청구항 11
(i) 제 3 항의 래트를 면역원으로 면역화시키는 단계; (ii) 래트로부터 단일클론 항체 생성 세포를 단리하는 단
계로서, 상기 단일클론 항체 생성 세포는 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 것인 단계;
(iii) 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 인코딩하는 단일클론 항체 핵산을 단일클론 항체 생성 세
포로부터 단리하는 단계; 및 (iv) 상기 단일클론 항체 핵산을 이용해 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론
항체를 생산하는 단계로서, 임의로 상기 단일클론 항체가 인간 이디오타입을 갖는 것인 단계
를 포함하는 단일클론 항체의 생산 방법.
청구항 12
제 11 항에 있어서, (i) 항체를 정제하는 단계; 및 (ii) 항체를 환자에 투여하기에 적합한 약제학적 담체와 혼
합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
청구항 13
(i) 제 3 항의 래트를 면역원으로 면역화시키는 단계; (ii) 래트로부터 단일클론 항체 생성 세포를 단리하는 단
계로서, 상기 단일클론 항체 생성 세포는 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 것인 단계;
(iii) 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 인코딩하는 단일클론 항체 핵산을 단일클론 항체 생성 세
포로부터 단리하는 단계; 및 (iv) 상기 단일클론 항체 핵산을 개질하여 완전한 인간 단일클론 항체를 인코딩하
는 재조합 핵산을 생산하는 단계; 및 (v) 상기 완전한 인간 단일클론 항체를 인코딩하는 재조합 핵산을 이용하
여 인코딩된 완전한 인간 단일클론 항체를 생산하는 단계
를 포함하는 단일클론 항체의 생산 방법.
청구항 14
제 13 항에 있어서, (i) 항체를 정제하는 단계; 및 (ii) 항체를 환자에 투여하기에 적합한 적절한 약제학적 담
체와 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
청구항 15
제 9 항의 방법에 의해 수득되는 세포로서, 상기 세포는 적어도 하나의 인간 J 유전자 분절을 포함하는 인공 Ig
유전자자리를 포함하고, 상기 인간 이디오타입을 갖는 항체는 인간 면역글로불린 폴리펩티드 서열 부분 및 래트
면역글로불린 폴리펩티드 서열 부분을 포함하는 키메라 면역글로불린인 세포.
청구항 16
제 11 항에 기재된 단일클론 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 형질전환 세포로서, 상기 핵산은 적어도 하나
의 인간 J 유전자 분절을 포함하는 인공 Ig 유전자자리를 포함하고, 상기 단일클론 항체는 인간 면역글로불린
폴리펩티드 서열 부분 및 래트 면역글로불린 폴리펩티드 서열 부분을 포함하는 키메라 면역글로불린인 형질전환
세포.
청구항 17
제 11 항의 방법에 의해 수득되는 단일클론 항체를 인코딩하는 단리된 핵산으로서, 상기 인공 Ig 유전자자리가
적어도 하나의 인간 J 유전자 분절을 포함하고, 상기 단일클론 항체는 인간 면역글로불린 폴리펩티드 서열 부분
및 래트 면역글로불린 폴리펩티드 서열 부분을 포함하는 키메라 면역글로불린인 단리된 핵산.
청구항 18
등록특허 10-1703299
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제 17 항의 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린.
청구항 19
제 18 항에 있어서, 상기 면역글로불린이 (i) 래트 불변 (C) 영역, 또는 (ii) 인간 및 래트 불변 (C) 영역으로
부터 유래되는 인공 불변 (C) 영역으로부터 선택되고, 임의로 상기 인공 불변 (C) 영역은 인간 IgG CH1 도메인
과 래트 IgG CH2 및 CH3 도메인을 갖는 것인 키메라 면역글로불린.
청구항 20
제 19 항의 핵산을 포함하는 형질전환 세포.
청구항 21
제 5 항에 있어서, 인간 이디오타입 면역글로불린을 생산할 수 있는 래트.
청구항 22
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청구항 23
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청구항 24
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청구항 25
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청구항 26
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청구항 27
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청구항 28
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청구항 29
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청구항 30
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청구항 31
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청구항 32
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청구항 34
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청구항 35
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청구항 37
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청구항 38
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청구항 48
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청구항 50
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청구항 51
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청구항 52
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청구항 53
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청구항 54
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발명의 설명
기 술 분 야
관련 출원의 교차 인용[0001]
본 출원은 본원에서 그 전체가 참조 인용되고 있는 2007 년 6 월 1 일에 제출된 U.S. 가특허 출원 시리즈 제[0002]
60/941,619 호 및 2008 년 4 월 11 일에 제출된 U.S. 가특허 출원 시리즈 제 61/044,324 호의 우선권을 주장한
다.
본 발명의 개요[0003]
본 발명은 하나 이상의 불활성화된 내생적 면역글로불린 유전자자리 (locus) 를 갖는 트랜스제닉 (transgenic)[0004]
동물 및 이의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 트랜스제닉 동물을 이용한 인간화 및 완전
한 인간 항체의 생산을 위한 조성물 및 방법, 및 그렇게 생산된 항체에 관한 것이다.
배 경 기 술
항체는 감염병, 암, 알레르기 질병 및 이식대숙주 병을 포함하는 각종 인간의 질병 및 병태의 치료뿐 아니라 이[0005]
식 거부의 예방에서도 성공적으로 사용되어졌던 중요한 부류의 약학적 산물이다.
비인간 면역글로불린의 치료학적 적용과 연계되는 한 가지 문제점은, 인간 환자에서 이들의 잠재적인 면역원성[0006]
이다. 이러한 제제의 면역원성을 감소시키기 위해, 부분 인간 (인간화) 및 완전한 인간 항체의 다양한 생산
전술이 개발되어 왔다. 항원결합 결정인자가 이디오타입 (idiotype) 영역 내에 존재하고, 비인간 이디오타
입은 현재 항체 치료학의 면역원성의 원인이 되는 것으로 여겨지므로, 비인간 동물에서 인간 이디오타입을 갖는
트랜스제닉 항체를 생산하는 능력이 특히 요구된다. 다클론 항체 혼합물에 의해 더 낮은 농도로 전달되는
다양한 이디오타입과는 대조적으로 비교적 높은 농도로 전해지는 단일의 이디오타입으로 이루어지는 단일클론
항체 치료학에 있어서, 인간 이디오타입은 매우 중요한 고려 사항이다.
비인간 동물에서 인간화 트랜스제닉 항체 생산에 대한 다수의 접근법이 기술되어져 있으나, 다수의 이러한 접근[0007]
법에서 부딪치는 한 가지 주요한 문제점은, 우선적으로 내생적 항체를 생산하는 것 또는 숙주 동물 내 트랜스제
닉 항체와 조합된 내생적 항체를 생산하는 것이다. 이러한 문제점을 다루기 위해, 숙주 동물에서 내생적 면
역글로불린 생산물을 분쇄하는 시도에서 각종 재조합 클로닝 계획을 세웠었다. 그러나, 면역글로불린 유전
자의 작용적 불활성화는 척추동물 종에서 많은 문제점을 보였다.
예를 들어, JH-유전자자리가 결손된 동종접합 돌연변이 마우스를 상동 재조합을 이용하여 성공적으로 생산하였[0008]
으나, ES 또는 기타 지속할 수 있는 다능성 세포는 (이때, 상동 재조합을 내생적 유전자자리를 불활성화하도록
사용할 수 있음) 대부분의 척추동물 종에서 용이하게 입수가능하지 않는다.
게다가, 면역글로불린 VDJ 또는 VJ 유전자-분절의 생산적 재배열이 아닌 세포 표면 발현을 방해하는 돌연변이는[0009]
등록특허 10-1703299
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내생적 Ig 발현을 완벽하게 불활성화하는데 불충분하다. 이는 μ 경쇄의 막 엑손이 단열된 동종접합 돌연변
이 마우스 (소위 μMT 마우스) 가 IgM 또는 IgG 를 생산할 수 없으나, 여전히 충분량의 IgA 를 생산한다는 사실
로 예시된다 (Macpehrson et al. Nature Immunol 2(7):625-631 (2001)). 게다가, 이종접합 돌연변이 마우
스의 혈청에는, 야생형 대립유전자 및 돌연변이된 μMT 대립유전자인 두 대립유전자로 인코딩된 IgM 및 IgG 이
함유되어 있다 (Kitamura 및 Rajewky, Nature 356:154-156 (1992)). 이는 B-세포 발달의 과정에서 제 1 의
재배열이 두 상동 염색체 상 DH- 및 JH-유전자 분절의 결합이므로 프로 B 세포 (pro-B cell) 을 생산한다는 점
에서 기인한다. 만약, μMT/ 마우스에서, 프로-B 세포가 우선 돌연변이된 IgH 유전자자리 내 VH-DHJH 결합
을 후속하여, 결합의 뼈대가 완성된다면 ("생산적"), 생성된 프리-B 세포 (pre-B cell) 는 분비된 형태의 μ사
슬을 발현할 수 있으나, 막-결합 μ 를 발현할 수 없다. 막 결합 μ 발현이 대립유전자 배제에 요구되기 때
문에, 그러한 세포는 여전히 야생형 IgH 유전자자리에서 VH-DHJH 결합을 행할 수 있고; 이러한 제 2 의 재배열
이 또한 생산적인 경우에는, 세포는 두 개의 상이한 μ 사슬을 발현하는데, 그 중 하나가 막-결합된다. 이
러한 마우스의 혈청은 두 대립유전자로부터 유도된 IgM 을 포함한다. 또한, 두 대립유전자로부터 유도된
IgG 가 상기 마우스의 혈청에서 발견될 수 있는데, 그 이유는 전환이 B 세포의 두 IgH 유전자자리 상에서 동시
에 종종 유도되기 때문이다.
불완전 대립유전자 배제가 또한, 여전히 VDJ 또는 VJ 유전자 분절을 생산적으로 재배열할 수 있는 돌연변이된[0010]
내생적 면역글로불린 유전자자리 및 작용적 트랜스제닉 면역글로불린 유전자자리를 갖는 동물에서 발견된다.
하나의 또는 두 돌연변이 내생적 유전자자리에서 VH-DHJH 를 재배열하는 B-세포는 여전히 트랜스제닉 면역글
로불린 유전자자리를 생산적으로 재배열할 수 있다. 이러한 B-세포는 막-결합 트랜스제닉 면역글로불린을
발현시켜 성숙한 B-세포로 발달한다. B-세포 발달 동안에, 돌연변이된 내생적 유전자자리 내 아이소타입 전
환으로 내생적 면역글로불린을 발현하는 B-세포가 도모된다. 따라서, 이러한 돌연변이는 트랜스제닉 면역글
로불린 유전자자리를 갖는 동물에서 내생적 면역글로불린 발현을 완전히 불활성화하는 데 부적당하다.
발명의 내용
해결하려는 과제
본 발명의 개요[0011]
비인간 동물에서 인간화 트랜스제닉 항체의 생산과 관련된 주요한 문제는, 숙주 내 내생적 항체의 우선적인 생[0012]
산 또는 공동-생산이었었다. 본 발명은 이러한 문제를, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 정박시켜 내생
적 면역글로불린을 생산하는 능력이 결핍된 트랜스제닉 동물을 제공함으로써 해결한다. 이들 동물은 인간화
및 완전한 인간 트랜스제닉 항체를 생산하는데 매우 유용하다. 이러한 트랜스제닉 동물을 생산하는데 사용
되는 방법은, ES 세포 또는 지속가능한 다능성 세포가 현재 용이하게 입수가능하지 않고, 상동 재조합 및 유전
자 녹아웃 (knockout) 이 용이하게 행해지지 않는 종을 포함하는 다수의 종에서 유효하다.
본 발명은 메가뉴클레아제 (meganuclease) 를 사용하여 내생적 면역글로불린 유전자자리를 작용적으로 제거해[0013]
인간화 및 완전한 인간 트랜스제닉 항체를 생산하는데 유용한 트랜스제닉 동물을 생산할 수 있다는 발견에서 일
부분 시작한다. 또한, 별개의 게놈 부위에 타겟팅하는 두 개의 별개의 메가뉴클레아제를 사용하여 면역글로
불린 유전자자리의 큰 부분 (수 kb 이하) 을 유효하게 결손시켜, 유전자자리의 완전한 불활성화를 확보하고, 생
식계열 돌연변이를 갖는 트랜스제닉 동물이 내생적 면역글로불린을 생산할 수 있는 임의의 B 세포를 생산하지
않는다는 것을 추가로 확보하였다.
과제의 해결 수단
따라서, 본 발명은 한 측면에서, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 포함하고, 적어도 하나의 생식계열의 불[0014]
활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 갖는 트랜스제닉 동물을 제공한다. 본 발명에서 사용되는 동물은 작은 실
험실 동물, 특히 조류, 설치류 및 족제비류이다. 본 발명에서 사용되는 인공 유전자자리는 적어도 하나의
인간 V 유전자 분절을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리는 (i) 생식계열 또는 초돌연변
이된 인간 V-영역 아미노산 서열을 인코딩하는 적어도 하나의 인간 V 유전자 분절을 가진 V-영역; (ii) 하나 이
상의 J 유전자 분절; 및 (iii) 하나 이상의 불변 영역 유전자를 포함하며, 이때 인공 Ig 유전자자리는 트랜스제
닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있다.
발명의 효과
등록특허 10-1703299
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한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 불활성화된 내생적 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다. 바람직한 구현예에[0015]
서, 트랜스제닉 동물은 두 내생적 Ig 중쇄 유전자자리를 불활성화시켜, 그에 따라 작용적인 내생적 Ig 중쇄 유
전자자리를 갖지 않는다.
한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 불활성화된 내생적 Ig 경쇄 유전자자리를 포함한다. 바람직한 구현예에[0016]
서, 트랜스제닉 동물은 두 내생적 Ig 경쇄 유전자자리를 불활성화시켜, 그에 따라 작용적인 내생적 Ig 경쇄 유
전자자리를 갖지 않는다.
바람직한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 작용적인 내생적 Ig 중쇄 유전자자리 및 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리[0017]
가 결핍되어 있다.
한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다. 한 구현예에서, 트[0018]
랜스제닉 동물은 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍되어 있으며, 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리를
포함한다.
한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함한다.[0019]
한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리 및 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유[0020]
전자자리를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리는 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 면[0021]
역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있는데, 이때 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입을 갖는 면역글로불
린을 포함한다.
한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리의 하나 이상의 불변 영역 유전자는 적어도 하나의 비인간 불변 영역 유전자[0022]
를 포함하며, 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 키메라 (chimeric) 면역글로불린
의 레퍼토리를 만들 수 있고, 이때 키메라 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입을 가진 키메라 면역글로
불린을 포함한다.
한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리의 하나 이상의 불변 영역 유전자는 적어도 하나의 인간 불변 영역을 포함하[0023]
며, 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수
있으며, 이때 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입 및 인간 불변 영역을 가진 면역글로불린이다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 트랜스제닉 동물의 자손을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 자손은 적어[0024]
도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 포함하고, 적어도 하나의 생식계열의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진
다.
한 측면에서, 본 발명은 불활성화된 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포를 생산[0025]
할 수 있는 트랜스제닉 동물을 제공한다.
한 구현예에서, 이러한 트랜스제닉 동물은 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 포함하며, 바람직하게 메가뉴클[0026]
레아제-인코딩 핵산에 작동적으로 연결된 유도성 발현 조절 영역을 가진 구축물을 포함하는데, 이때 인코딩된
메가뉴클레아제는 트랜스제닉 동물의 내생적 Ig 유전자자리에 또는 그 부근에 존재하는 메가뉴클레아제 타겟 서
열을 인지한다. 트랜스제닉 동물이 성적으로 성숙하고 생존가능한 생식 세포를 포함하며, 게놈 메가뉴클레
아제 발현 구축물을 사용하여, 실험실 내 또는 생체 내에서 이러한 생식 세포 내 타겟팅된 내생적 Ig 유전자자
리를, 그의 생존력을 타협하지 않은 채 불활성할 수 있는 경우, Ig 유전자자리에 생식계열 돌연변이를 갖는 F1
동물 확보가 이로부터 유도될 수 있다.
한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 추가로 포함한다.[0027]
한 측면에서, 본 발명은 생존가능한 생식 세포를 포함하는 트랜스제닉 동물을 제공하는데, 이때 적어도 하나의[0028]
내생적 Ig 유전자자리가 불활성화되어 있다. 한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 적어도 하나의 인공 Ig 유
전자자리를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 트랜스제닉 동물의 생산 방법을 제공한다.[0029]
한 구현예에서, 본 발명은 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 포함하고, 적어도 하나의 생식계열의 불활성화[0030]
된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 트랜스제닉 동물의 생산 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 트랜스제
닉 동물은 내생적 Ig 경쇄 및/또는 내생적 Ig 중쇄에 있어서 무접합형 (nullizygous) 이다.
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바람직하게도, 내생적 Ig 유전자자리는 모 생식 세포 또는 선조 (predecessor) 의 생식 세포에서 그 안의 메가[0031]
뉴클레아제의 발현에 의해 불활성화된다. 상기 방법은 생식 세포 내 메가뉴클레아제를 생산하는 것을 포함
하는데, 이때 상기 메가뉴클레아제는 내생적 Ig 유전자자리에 또는 그 부근에 존재하는 메가뉴클레아제 타겟 서
열을 인지하고, 생식 세포 내 타겟팅된 Ig 유전자자리를 선택적으로 불활성화시켜, 적어도 하나의 불활성화된
내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포를 생산한다. 이러한 적어도 하나의 불활성화된 내생적
Ig 유전자자리를 가진 생식 세포가, 적어도 하나의 생식계열의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 동물을
생산하는데 사용된다. 한 구현예에서, 생식 세포, 또는 이것이 조합하고 있는 것은 적어도 하나의 인공 Ig
중쇄 유전자자리를 포함한다. 한 구현예에서, 생식 세포, 또는 이것이 조합하고 있는 것은 적어도 하나의
인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함한다. 한 구현예에서, 생식 세포, 또는 이것이 조합하고 있는 것은 적어도
하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리 및 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다.
한 구현예에서, 상기 방법은 메가뉴클레아제 발현 구축물 또는 메가뉴클레아제-인코딩 핵산을 생식 세포에 도입[0032]
하는 것을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 생식 세포는 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 포함하는데, 이는 메가뉴클레아제-인코[0033]
딩 핵산에 작동적으로 연결된 발현 조절 영역을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 생식 세포는 유도성 게놈
메가뉴클레아제 발현 구축물을 포함하고, 상기 방법은 생식 세포에 메가뉴클레아제-인코딩 핵산의 발현을 유도
하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 방법은 생식 세포에 메가뉴클레아제-인코딩 핵산의 발현을 유도
하는 단계를 반복하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 유도는 생체 내에서 행해진다. 또 다른 구현예에
서, 유도는 실험실 내에서 행해진다. 한 구현예에서, 생식 세포는 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 포함
하고, 이는 생식 세포-특이 활성을 나타내는 발현 조절 영역을 포함한다.
생성된 생식 세포는 적어도 하나의 생식계열의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 F1 동물을 생산하는데[0034]
사용될 수 있다. F1 동물은 하나 이상의 인공 Ig 유전자자리를 포함할 수 있거나, 또는 적어도 하나의 인공
Ig 유전자자리를 포함하는 그러한 동물을 생산하도록 교배될 수 있다.
대안적인 구현예에서, 상기 방법은 메가뉴클레아제 발현 구축물 또는 메가뉴클레아제-인코딩 핵산을 수정된 난[0035]
모세포 또는 배아로 도입하고, 수득한 시조 (founder) 동물에 적어도 하나의 불활성화된 Ig 유전자자리를 가진
생존가능한 생식 세포를 생산하는 것을 포함한다. 시조 동물이 적어도 하나의 생식계열의 불활성화된 내생
적 Ig 유전자자리를 가진 F1 동물을 생산하는데 사용될 수 있다. F1 동물은 하나 이상의 인공 Ig 유전자자리
를 포함할 수 있거나, 또는 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 포함하는 상기 동물을 생산하도록 교배될 수
있다.
한 구현예에서, 메가뉴클레아제 타겟 서열은 J 유전자 분절에 또는 그 부근에 존재한다.[0036]
한 구현예에서, 메가뉴클레아제 타겟 서열은 면역글로불린 불변 영역 유전자 분절에 또는 그 부근에 존재한다.[0037]
바람직한 구현예에서, 불변 영역 유전자는 면역글로불린 μ 를 인코딩한다.
한 구현예에서, 상기 방법은 내생적 Ig 유전자자리의 불활성화 및 생존능에 대해서 생식 세포를 스크리닝[0038]
(screening) 하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 방법은 인공 Ig 유전자자리의 존재에 대해서 생식
세포를 스크리닝하는 것을 포함한다.
본원의 방법에서, 동물의 교배를 불활성화된 내생적 유전자자리를 가진 동물들 간에서 하여, 내생적 Ig 경쇄 및[0039]
/또는 내생적 Ig 중쇄에 있어서 무접합형인 동물을 생산하는 것이 바람직하다.
바람직한 구현예에서, 상기 방법은 제 2 의 메가뉴클레아제의 사용을 추가로 포함한다. 제 2 의 메가뉴클레[0040]
아제는 내생적 Ig 유전자자리에 또는 그 부근에 존재하는 제 2 의 메가뉴클레아제 타겟 서열을 인지하여, 제 1
의 메가뉴클레아제와 함께, 그러나 제 1 의 메가뉴클레아제의 부위와는 상이한 부위에서 내생적 Ig 유전자자리
를 선택적으로 절단함으로써, 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리를 불활성화시킨다.
바람직한 구현예에서, 생식 세포는 제 2 의 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 포함하는데, 이는 제 2 의 메가[0041]
뉴클레아제-인코딩 핵산에 작동적으로 연결된 발현 조절 영역을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 발현 조절
영역은 유도성 발현 조절 영역이고, 방법은 생식 세포 내에 제 2 의 메가뉴클레아제-인코딩 핵산의 발현을 유도
하는 것을 추가로 포함하여, 인코딩된 제 2 의 메가뉴클레아제가 생산되어, 제 2 의 메가뉴클레아제와 함께 생
식 세포 내 타겟팅된 Ig 유전자자리를 선택적으로 불활성화시킨다. 한 구현예에서, 상기 방법은 생식 세포
내 제 2 의 메가뉴클레아제-인코딩 핵산의 발현을 유도하는 단계를 반복하는 것을 포함한다. 한
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구현예에서, 유도는 생체 내에서 행해진다. 한 구현예에서, 유도는 실험실 내에서 행해진다. 한 구현예
에서, 제 2 의 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물은 생식 세포-특이 활성을 나타내는 발현 조절 영역을
포함한다.
대안적인 구현예에서, 상기 방법은 제 2 의 메가뉴클레아제 발현 구축물 또는 제 2 의 메가뉴클레아제-인코딩[0042]
핵산을 생식 세포로 도입하는 것을 포함한다.
대안적인 구현예에서, 상기 방법은 제 2 의 메가뉴클레아제 발현 구축물 또는 제 2 의 메가뉴클레아제-인코딩[0043]
핵산을 수정된 난모세포 또는 배아에 도입하고, 수득한 시조 동물에서 적어도 하나의 불활성화된 Ig 유전자자리
를 가진 생존가능한 생식 세포를 생산하는 것을 포함한다. 시조 동물이 적어도 하나의 생식계열의 불활성화
된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 F1 동물을 생산하는데 사용될 수 있다. F1 동물은 하나 이상의 인공 Ig 유
전자자리를 포함할 수 있거나, 또는 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 포함하는 상기 동물을 생산하도록, 교
배될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 제 1 및 제 2 의 메가뉴클레아제는 J 유전자 분절을 타겟팅한다. 한 구현예에서, 제[0044]
1 및 제 2 의 메가뉴클레아제 타겟 서열은, 내생적 Ig 유전자자리 내 하나 이상의 J 유전자 분절의 상류 및 하
류에서 함께 취해져, 제 1 및 제 2 의 인코딩된 메가뉴클레아제가 절단하여 하나 이상의 J 유전자 분절을 포함
하는 게놈 DNA 분절을 결손한다.
또 다른 구현예에서, 제 1 및 제 2 의 메가뉴클레아제는 불변 영역 유전자 분절을 타겟팅한다. 한 구현예에[0045]
서, 제 1 및 제 2 의 메가뉴클레아제 타겟 서열은 하나 이상의 면역글로불린 불변 영역 유전자 분절의 상류 및
하류에서 함께 취해져, 제 1 및 제 2 의 인코딩된 메가뉴클레아제가 절단하여 하나 이상의 면역글로불린 불변
영역 유전자 분절을 포함하는 게놈 DNA 분절을 결손한다. 바람직한 구현예에서, 불변 영역 유전자는 면역글
로불린 μ 을 인코딩한다.
본원의 방법에서, 사용되는 인공 유전자자리는 적어도 하나의 인간 V 유전자 분절을 포함한다. 바람직한 구[0046]
현예에서, 인공 Ig 유전자자리는, (i) 생식계열 또는 초돌연변이된 인간 V-영역 아미노산 서열을 인코딩하는 적
어도 하나의 인간 V 유전자 분절을 가진 V-영역; (ii) 하나 이상의 J 유전자 분절; 및 (iii) 하나 이상의 불변
영역 유전자를 포함하며, 이때 인공 Ig 유전자자리는 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수
있어 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리가 본 발명의 트랜스제닉 동물의 게놈에 삽입된다.[0047]
한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍되어 있다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리가 본 발명의 트랜스제닉 동물의 게놈에 삽입된다.[0048]
*한 구현예에서, 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리 및 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리가 본 발명[0049]
의 트랜스제닉 동물의 게놈에 삽입된다.
바람직한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리는 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어,[0050]
면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있는데, 상기 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입을 가진 면역글로
불린을 포함한다.
한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리의 하나 이상의 불변 영역 유전자는 적어도 하나의 비인간 불변 영역 유전자[0051]
를 포함하고, 트랜스제닉 동물에서 유전자 재배열을 행할 수 있어, 키메라 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수
있는데, 상기 키메라 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입을 가진 키메라 면역글로불린을 포함한다.
한 구현예에서, 인공 Ig 유전자의 하나 이상의 불변 영역 유전자는 적어도 하나의 인간 불변 영역 유전자를 포[0052]
함하고, 트랜스제닉 동물에서 유전자 재배열을 행할 수 있어, 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있는데, 상기
면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입 및 인간 불변 영역을 가진 면역글로불린을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명의 트랜스제닉 동물을 생산하는 방법은, 적어도 하나의 생식계열의 불활성화된 내생적[0053]
Ig 유전자자리를 가진 트랜스제닉 동물을 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 가진 제 2 의 트랜스제닉 동물과
교배하여 (이때 상기 유전자자리는 (i) 생식계열 또는 초돌연변이된 인간 V-영역 아미노산 서열을 인코딩하는
적어도 하나의 인간 V 유전자 분절을 가진 V-영역; (ii) 하나 이상의 J 유전자 분절; 및 (iii) 하나 이상의 불
변 영역 유전자를 포함함), F1 트랜스제닉 동물을 생산하는 것을 포함하는데, 이때 F1 트랜스제닉 동물은 제 2
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의 트랜스제닉 동물의 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 포함하고, 제 2 의 트랜스제닉 동물 유래의 인공 Ig
유전자자리는 F1 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 면역글로불린의 레퍼토리를 만
들 수 있다. 교배는 동물 번식 (breeding) 에 의해 또는 그 밖에 실험실 내 조작을 포함하는 배우자 조합에
의해서 행할 수 있다.
한 구현예에서, 제 2 의 트랜스제닉 동물은 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다.[0054]
한 구현예에서, 제 2 의 트랜스제닉 동물은 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함한다.[0055]
한 구현예에서, 제 1 및 제 2 의 트랜스제닉 동물은 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍되어 있고, 제 2 의 트[0056]
랜스제닉 동물은 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다. 동물들은 교배되어 작용적인 Ig 경쇄 유전자자가 결
핍되고 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함하는 F1 을 생산할 수 있다.
한 구현예에서, 제 2 의 트랜스제닉 동물은 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리 및 적어도 하나의 인공 Ig[0057]
경쇄 유전자자리를 포함해, 적어도 2 개의 인공 Ig 유전자자리를 포함한다. 한 구현예에서, 제 2 의 트랜스
제닉 동물의 인공 Ig 유전자자리는 F1 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어, 면역글
로불린의 레퍼토리를 만들 수 있으며, 상기 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입을 가진 면역글로불린을
포함한다. 한 구현예에서, 제 2 의 트랜스제닉 동물의 인공 Ig 유전자자리의 하나 이상의 불변 영역 유전자
는 적어도 하나의 비인간 불변 영역 유전자를 포함하며, F1 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을
행할 수 있어 키메라 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있는데, 상기 키메라 면역글로불린의 레퍼토리는 인간
이디오타입을 가진 키메라 면역글로불린을 포함한다. 한 구현예에서, 제 2 의 트랜스제닉 동물의 인공 Ig
유전자자리의 하나 이상의 불변 영역 유전자는 적어도 하나의 인간 불변 영역 유전자를 포함하며, F1 트랜스제
닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있는데, 상기 면역
글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입 및 인간 불변 영역을 가진 면역글로불린을 포함한다.
마찬가지로, 한 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 가진 제 2 의 트랜스제닉[0058]
동물을, 불활성화된 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포를 생산할 수 있는 본 발
명의 트랜스제닉 동물과 교배하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 제 2 의 트랜스제닉 동물은 적어도
하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리 및 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함해, 적어도 2 개의 인공 Ig
유전자자리를 포함한다.
한 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 메가뉴클레아제의 활성에 의해 불활성화되어 있거나, 또는 불활성화될[0059]
수 있는 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생식 세포로, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 도입하
는 것을 포함하는데, 이때 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리는 (i) 생식계열 또는 초돌연변이된 인간 V-영역
아미노산 서열을 인코딩하는 적어도 하나의 인간 V 유전자 분절을 가진 V-영역; (ii) 하나 이상의 J 유전자 분
절; 및 (iii) 하나 이상의 불변 영역 유전자를 포함하고, 여기서 인공 Ig 유전자자리는 생식 세포에서 유도된
트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 인공 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있다.
상기 방법은 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 포함하고, 하나 이상의 메가뉴클레아제의 작용에 의해 불
활성화된 적어도 하나의 생식계열의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 F1 트랜스제닉 동물을 그렇게 생
산된 생식 세포로부터 유도하는 것을 추가로 포함한다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리는 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다.[0060]
한 구현예에서, 생식 세포는 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍되어 있으며, 생식 세포에 도입된 인공 Ig 유[0061]
전자자리는 Ig 중쇄 유전자자리이다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리는 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함한다.[0062]
바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리 및 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포[0063]
함해, 적어도 2 개의 인공 유전자자리가 생식 세포에 도입된다. 한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리는 유도
된 F1 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있으
며, 상기 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입을 가진 면역글로불린을 포함한다. 한 구현예에서, 인
공 Ig 유전자자리의 하나 이상의 불변 영역 유전자는 적어도 하나의 비인간 불변 영역 유전자를 포함하며, 유도
된 F1 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 키메라 면역글로불린의 레퍼토리를 만들
수 있으며, 상기 키메라 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입을 가진 키메라 면역글로불린을 포함한다.
한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리의 하나 이상의 불변 영역 유전자는 적어도 하나의 인간 불변 영역 유전
자를 포함하며, 유도된 F1 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 면역글로불린의 레퍼
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토리를 만들 수 있으며, 상기 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입 및 인간 불변 영역을 가진 면역글로
불린을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 방법은 내생적 Ig 유전자자리의 불활성화 및 생존능에 대해서 생식 세포를 스크리닝하는[0064]
것을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 방법은 인공 Ig 유전자자리의 존재에 대해서 생식 세포를 스크리닝하
는 것을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를, 하나 이상의 메가뉴클레아제의 작용에 의해[0065]
불활성화되었거나 또는 불활성화될 수 있는 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생식 세포로부터 유도
된 수정된 난모세포 또는 배아에 도입하는 것을 포함하는데, 이때, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리는 (i) 생
식계열 또는 초돌연변이된 인간 V-영역 아미노산 서열을 인코딩하는 적어도 하나의 인간 V 유전자 분절을 가진
V-영역; (ii) 하나 이상의 J 유전자 분절; 및 (iii) 하나 이상의 불변 영역 유전자를 포함하며, 여기서 인공 Ig
유전자자리는 상기 수정된 난모세포 또는 배아에서부터 유도된 시조 트랜스제닉 동물 또는 그의 자손에서 작용
적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어, 인공 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있다. 상기 방법은 수정
된 난모세포 또는 배아로부터 시조 트랜스제닉 동물, 및 임의로는 그의 자손을 유도하여, 적어도 하나의 인공
Ig 유전자자리를 포함하고, 하나 이상의 메가뉴클레아제의 작용에 의해 불활성화된 적어도 하나의 생식계열의
불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 트랜스제닉 동물을 수득하는 것을 추가로 포함한다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리는 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다.[0066]
한 구현예에서, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리는 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함한다.[0067]
한 구현예에서, 수정된 난모세포 또는 배아는 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍되어 있고, 수정된 난모세포[0068]
또는 배아에 도입된 인공 Ig 유전자자리는 Ig 중쇄 유전자자리이다.
바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리 및 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포[0069]
함해, 적어도 2 개의 인공 유전자자리는 수정된 난모세포 또는 배아에 도입된다. 한 구현예에서, 인공 Ig
유전자자리는 시조 트랜스제닉 동물 또는 그의 자손에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어, 면역글로불
린의 레퍼토리를 만들수 있는데, 이때 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입을 가진 면역글로불린을 포함
한다. 한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리의 하나 이상의 불변 영역 유전자는 적어도 하나의 비인간 불변
영역 유전자를 포함하며, 시조 트랜스제닉 동물 또는 그의 자손에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어
키메라 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있으며, 이때 상기 키메라 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오
타입을 가진 키메라 면역글로불린을 포함한다. 한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리의 하나 이상의 불변 영
역 유전자는 적어도 하나의 인간 불변 영역 유전자를 포함하며, 시조 트랜스제닉 동물 또는 그의 자손에서 작용
적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어, 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있으며, 이때 면역글로불린의 레퍼
토리는 인간 이디오타입 및 인간 불변 영역을 가진 면역글로불린을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리가 불활성화된 생존가능한 생식 세포를 생산할 수[0070]
있는 트랜스제닉 동물을 생산하는 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 발현 구축물이 메가
뉴클레아제-인코딩 핵산에 작동적으로 연결된 발현 조절 영역을 포함하는 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을
가진 트랜스제닉 동물을 생산하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 구축물은 생식 세포 내 메가뉴클레
아제-인코딩 핵산을 발현하도록 유도될 수 있는 유도성 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물이다.
한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리가 불활성화된 생존가능한 생식 세포를 가진 트랜[0071]
스제닉 동물을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 생식 세포, 또는 모 생식 세포 또는 이로부터 유도
된 수정된 난모세포 또는 배아에서 그 안의 메가뉴클레아제의 발현으로 내생적 Ig 유전자자리를 불활성화시키는
것을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리가 불활성화될 수 있는 생존가능한 생식 세포를 제[0072]
공한다. 바람직한 구현예에서, 생식 세포는 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 포함하는데, 이때 발현 구
축물은 메가뉴클레아제-인코딩 핵산에 작동적으로 연결된 발현 조절 영역을 포함한다. 바람직한
구현예에서, 구축물은 생식 세포에서 메가뉴클레아제-인코딩 핵산을 발현하도록 유도될 수 있는 유도성 게놈 메
가뉴클레아제 발현 구축물이다.
한 구현예에서, 생식 세포는 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다.[0073]
한 구현예에서, 생식 세포는 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함한다.[0074]
등록특허 10-1703299
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한 구현예에서, 생식 세포는 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리 및 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자[0075]
리를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리가 불활성화된 생존가능한 생식 세포를 제공한다.[0076]
한 구현예에서, 생식 세포는 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다.[0077]
한 구현예에서, 생식 세포는 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함한다.[0078]
한 구현예에서, 생식 세포는 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리 및 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자[0079]
리를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포를 생산[0080]
하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 생식 세포, 수정된 난모세포 또는 배아에서 적어도 하나의 메가뉴클레
아제를 발현시켜, 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포를 생산하는 것
을 포함한다. 상기와 같이 발현된 메가뉴클레아제는 상기 내생적 Ig 유전자자리에 또는 그 부근에 존재하는
메가뉴클레아제 타겟 서열을 인지한다.
메가뉴클레아제가 생식 세포에서 발현되는 한 구현예에서, 메가뉴클레아제가 발현하는 생식 세포는 적어도 하나[0081]
의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포를 제공한다. 대안으로, 적어도 하나의
불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능 생식 세포는 메가뉴클레아제가 발현된 생식 세포로부터 유도
된 동물에서 수득가능하다.
메가뉴클레아제가 수정된 난모세포 또는 배아에서 발현된 한 구현예에서, 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig[0082]
유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포는, 메가뉴클레아제가 발현된 수정된 난모세포 또는 배아로부터 유도된
동물로부터 수득될 수 있다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리는 실험실 내에서 불활성화된다. 한 구현예에서, 적어[0083]
도 하나의 내생적 Ig 유전자자리는 생체 내에서 불활성화된다.
한 구현예에서, 생식 세포는 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 적어도[0084]
하나의 인공 Ig 유전자자리는 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다. 한 구현예에서, 적어도
하나의 인공 Ig 유전자자리는 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함한다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리 및 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함해,[0085]
적어도 2 개의 인공 Ig 유전자자리는 생식 세포에 도입된다.
본 발명은 또한 다클론 항체, 단일클론 항체, 하이브리도마, 및 상기의 이용 및 생산 방법을 제공하는데, 이는[0086]
하나 이상의 인공 유전자자리를 포함하고, 메가뉴클레아제 활성에 의해 불활성화된 하나 이상의 내생적 Ig 유전
자자리를 가진 현재 개시된 트랜스제닉 동물 내 항체의 생산에서 출발한다.
한 구현예에서, 항체는 본원에서 기술된 방법에 의해 성취된, 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍되어 있고 인[0087]
공 중쇄 유전자자리를 포함하는 트랜스제닉 동물을 이용해 생산된, 중쇄 독존의 (heavy chain-only) 항체이다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에서 제공된 트랜스제닉 동물을 이용해 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 이[0088]
방법은 본 발명의 트랜스제닉 동물을 면역원으로 면역화하는 것을 포함하는데, 상기 동물은 본원에서 기술된 바
와 같이 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가지며, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 포함
한다. 바람직한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 내생적 Ig 중쇄 및/또는 내생적 Ig 경쇄에 있어서 무접합형
이므로, 내생적 면역글로불린을 생산할 수 없다. 한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 작용적인 Ig 경쇄 유전
자자리가 결핍되어 있으며, 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 상기대로 생산된 다클론 항혈청 조성물을 제공한다. 본 발명의 다클론 항혈청은 인[0089]
간 이디오타입을 가진 항체를 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 구현예에서, 다클론 항혈청은 본질적으
로는 인간 이디오타입을 가진 항체로 이루어진 항체를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 단일클론 항체를 생산하는 방법을 제공한다.[0090]
한 구현예에서, 방법은 (i) 본 발명의 트랜스제닉 동물을 면역원으로 면역화하는 것으로 이때 상기 동물은 본원[0091]
에서 기술된 바와 같이 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가지며, 적어도 하나의 인공 Ig 유전
자자리를 보유함; (ii) 단일클론 항체 생산 세포를 트랜스제닉 동물에서부터 단리시키는 것으로, 이때 상기 단
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일클론 항체 생산 세포는 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산함; 및 (iii) 단일클론 항체 생산
세포를 이용해, 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산, 또는 단일클론 항체 생산 세포를 이용해,
단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 생산, 및 하이브리도마 세포를 이용해 단일클론 항체를 생산하
는 것을 포함한다.
한 구현예에서, 방법은 (i) 본 발명의 트랜스제닉 동물을 면역원으로 면역화하는 것으로, 이때 상기 동물은 본[0092]
원에서 기술된 바와 같이 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 갖고, 적어도 하나의 인공 Ig 유전
자자리를 보유함; (ii) 단일클론 항체 생산 세포를 트랜스제닉 동물로부터 단리시키는 것으로, 이때 단일클론
항체 생산 세포는 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산함; (iii) 단일클론 항체 생산 세포로부
터, 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 인코딩하는 단일클론 항체 핵산을 단리시키는 것; 및 (iv)
단일클론 항체 핵산을 이용해 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 것을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 단일클론 항체는 인간 이디오타입을 가진다.[0093]
한 측면에서, 본 발명은 상기대로 생산된 단일클론 항체를 제공한다.[0094]
한 측면에서, 본 발명은 상기의 단일클론 항체를 인코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.[0095]
한 측면에서, 본 발명은 완전한 인간 단일클론 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, (i) 본 발[0096]
명의 트랜스제닉 동물을 면역원으로 면역화하는 것으로, 이때 상기 동물은 본원에서 기술된 바와 같이 적어도
하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가지며, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 보유함; (ii) 단일클
론 항체 생산 세포를 트랜스제닉 동물로부터 단리시키는 것으로, 이때 단일클론 항체 생산 세포는 면역원에 특
이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산함; (iii) 단일클론 항체 생산 세포로부터, 면역원에 특이적으로 결합
하는 단일클론 항체를 인코딩하는 단일클론 항체 핵산을 단리하는 것; (iv) 단일클론 항체 핵산을 개질하여 완
전한 인간 단일클론 항체를 인코딩하는 재조합 핵산을 생산하는 것; 및 (v) 완전한 인간 단일클론 항체를 인코
딩하는 재조합 핵산을 이용해 인코딩된 완전한 인간 단일클론 항체를 생산하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 상기대로 생산된 완전한 인간 단일클론 항체를 제공한다.[0097]
한 측면에서, 본 발명은 완전한 인간 단일클론 항체를 인코딩하는 재조합 핵산 및 이의 생산 방법을 제공한다.[0098]
한 구현예에서, 본원에서의 방법에 사용되는 면역원은 질병을 유발하는 유기체 또는 그의 항원성 부분을 포함한[0099]
다.
*한 구현예에서, 본원에서의 방법에 사용되는 면역원은 인간에 대해 내생적인 항원이다. 대안적인 구현예에[0100]
서, 본원 방법에서 사용된 면역원은 인간에 대해 외인성인 항원이다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 신체 성분에서 항원체 (antigenic entity) 의 활성을 중화 또는 조절하는 방법을[0101]
제공한다. 한 구현예에서, 상기 방법은 신체 성분을 본 발명의 다클론 항혈청 조성물과 접촉시키는 것을 포
함하는데, 이때 다클론 항혈청 조성물은 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 포함하며 항원체의 활성을
중화 또는 조절한다.
한 구현예에서, 상기 방법은 신체 성분을 본 발명의 단일클론 항체와 접촉하는 것을 포함하는데, 이때 단일클론[0102]
항체가 특이적으로 결합하고 항원체의 활성을 중화 또는 조절한다.
바람직한 구현예에서, 단일클론 항체는 완전한 인간 단일클론 항체이다.[0103]
한 구현예에서, 항원체는 감염병을 야기하는 유기체의 것이다.[0104]
한 구현예에서, 항원체는 세포 표면 분자이다.[0105]
한 구현예에서, 항원체는 인간 사이토카인 또는 인간 케모카인이다.[0106]
한 구현예에서, 항원체는 악성 암 세포 상 세포 표면 분자이다.[0107]
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 트랜스제닉 동물로부터 유도된 세포를 제공한다.[0108]
바람직한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 트랜스제닉 동물의 비장으로부터 유도된 세포를 제공한다.[0109]
바람직한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 트랜스제닉 동물로부터 유도된 B 세포를 제공하는데, 상기 B 세포는[0110]
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인간 이디오타입을 가진 항체를 생산할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 트랜스제닉 동물로부터 유도된 생식 세포를 제공한다.[0111]
한 측면에서, 본 발명은 인간 이디오타입을 가진 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 생산하는 방법을 제공[0112]
한다. 상기 방법은 본 발명의 트랜스제닉 동물로부터 유도된 세포를 이용하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 상기대로 생산된 하이브리도마를 제공한다.[0113]
한 측면에서, 본 발명은 인간 이디오타입을 가진 항체를 제공하는데, 상기 항체는 본 발명의 하이브리도마에 의[0114]
해 생산된다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 이때 상기 항체는 인간 이디오[0115]
타입을 가진다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 약학적 조성물의 치료학적 유효량을 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는[0116]
것을 포함하는 상기 환자의 치료 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1 은 인간 V-, D, 및 J-영역, 래트의 인트론 인핸서 (enhancer) 및 몇몇 인공 불변 영역 유전자로 이루어진[0117]
인공 중쇄를 개략적으로 나타낸다. 인공 불변 영역 유전자는 인간 CH1 도메인 및 래트 CH2, 3 및 4 도메인
을 인코딩하는 엑손을 포함한다. 막 횡단 (Membrane spanning) 및 세포질 폴리펩티드 서열이 래트 엑손에
의해 인코딩된다.
도 2. 인지 서열의 3'말단에서 DNA 및 I-Scel 의 상호작용의 개략도.
도 3. I-Scel 인지 서열의 5'말단의 I-Scel 과의 상호작용의 개략도.
도 4. I-Crel 의 서열 인지 메카니즘의 개략도 (출처: Nucleic Acids Res., 34, 4791-4800).
도 5. I-Crel 의 인지 서열 변경 전략의 개략적인 도식.
도 6. 래트 IgM 을 인코딩하는 서열에 대해 고안된 징크-핑거 단백질 (Zinc-finger proteins; ZFP) 을 세포에
서 발현하고, 염색체 DNA 를 준비하고, IgM 유전자자리의 적절한 영역을 PCR 증폭했다. 반응 생산물을 폴리
아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석했다. 이 도는 절단 활성을 입증하는 전형적인 예를 나타낸다.
본 발명의 상세한 설명
"인공 면역글로불린 유전자자리" 란, 적어도 하나의 가변 영역 (V) 유전자 분절, 하나 이상의 J 유전자 분절,
하나 이상의 D 유전자 분절 (중쇄 유전자자리의 경우임), 및 하나 이상의 불변 영역 유전자 분절을 포함하는 다
수의 면역글로불린 유전자 분절을 포함해, 인간 및 비인간 면역글로불린 유전자자리 단편을 포함하는 면역글로
불린 유전자자리를 의미한다. 본 발명에서, V 유전자 분절 중 적어도 하나는 생식계열 또는 초돌연변이된
인간 V-영역 아미노산 서열을 인코딩한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 면역글로불린 유전자자리
는 작용적이고 재배열이 가능하여 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있다. 바람직한 구현예에서, 적어도
하나의 D 유전자 분절은 인간 D 유전자 분절이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "인공 Ig 유전자자리" 는
재배열되지 않은 유전자자리, 부분적으로 재배열된 유전자자리 및 재배열된 유전자자리를 지칭할 수 있다.
인공 Ig 유전자자리는 인공 Ig 경쇄 유전자자리 및 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다. 한 구현예에서,
인공 Ig 유전자자리는 비인간 C 영역 유전자를 포함하고, 비인간 C 영역을 가진 키메라 면역글로불린을 포함하
는 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있다. 한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리는 인간 C 영역 유전자를
포함하고, 인간 C 영역을 가진 면역글로불린을 포함하는 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있다. 한 구현
예에서, 인공 Ig 유전자자리는 "인공 불변 영역 유전자" 를 포함하는데, 이는 인간 및 비인간 불변 영역 유전자
로부터 유도된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 불변 영역 유전자를 의미한다. 예를 들어, 예시적인 인공 C
불변 영역 유전자는, 인간 IgG CH1 도메인 및 래트 IgG CH2 및 CH3 도메인을 인코딩하는 불변 영역 유전자이다.
일부 구현예에서, 인공 Ig 중쇄 유전자자리는 CH1, 또는 결과로서 생기는 면역글로불린이 전형적인 면역글로불
린 : 샤페론 (chaperone) 연합을 우회시키는 상기와 동등한 서열이 결핍되어 있다. 이러한 인공 유전자자리
는 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍되어 작용적인 Ig 경쇄를 발현하지 않는 트랜스제닉 동물에서 중쇄 독존
의 항체의 생산에 대비한다. 이러한 인공 Ig 중쇄 유전자자리는 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍되어
있고 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함하는 트랜스제닉 동물을 생산하는 데 본원의 방법 중에서 사용되며, 이때
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상기 동물은 중쇄 독존의 항체를 도출할 수 있다. 대안적으로, 인공 Ig 유전자자리는 제자리에서 (in situ)
조작되어 CH1 또는 이와 동등한 영역을 붕괴할 수 있어, 중쇄 독존의 항체의 생산에 대비하는 인공 Ig 중쇄 유
전자자리를 생산할 수 있다. 중쇄 독존의 항체를 경쇄-결핍 마우스에서 생산하는 것에 관해서는, 예를 들어
문헌 [Zou et al., JEM, 204:3271-3283, 2007] 을 참조한다.
"인간 이디오타입" 이란, 면역글로불린 V-유전자 분절에 의해 인코딩된 인간 항체 상에 존재하는 폴리펩티드 서
열을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "인간 이디오타입" 은, 인간 항체의 천연발생 서열과 천
연발생 인간 항체에서 발견되는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 합성 서열 모두를 포함한다. "실질적으로"
란, 아미노산 서열 상동성 정도가 적어도 약 85%-95% 임을 의미한다. 바람직하게는, 아미노산 서열 상동성
정도가 90% 초과, 더욱 바람직하게는 95% 초과이다.
"키메라 항체" 또는 "키메라 면역글로불린" 은, 인간 면역글로불린 폴리펩티드 서열 (또는 인간 Ig 유전자 분절
에 의해 인코딩된 폴리펩티드 서열) 의 부분 및 비인간 면역글로불린 폴리펩티드 서열의 부분을 포함하는 면역
글로불린 분자를 의미한다. 본 발명의 키메라 면역글로불린 분자는 비인간 Fc-영역 또는 인공 Fc-영역, 및
인간 이디오타입을 가진 면역글로불린이다. 이러한 면역글로불린은 키메라 면역글로불린 분자를 생산하도록
조작되어진 본 발명의 동물로부터 단리될 수 있다.
"인공 Fc-영역" 은, 인공 불변 영역 유전자에 의해 인코딩된 Fc-영역을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "Ig 유전자 분절" 이란, Ig 분자의 다양한 부분을 인코딩하는 DNA 분절을 지
칭하는데, 이는 비인간 동물 및 인간의 생식 계열에 존재하며, B 세포에서 함께 취해져 재배열된 Ig 유전자를
형성한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같은 Ig 유전자 분절은 V 유전자 분절, D 유전자 분절, J 유전
자 분절 및 C 영역 유전자 분절을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "인간 Ig 유전자 분절" 은, 인간 Ig 유전자 분절의 천연 발생 서열, 인간 Ig
유전자 분절의 천연 발생 서열의 변성형뿐 아니라 인간 Ig 유전자 분절의 천연 발생 서열로 인코딩된 폴리펩티
드와 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 합성 서열 모두를 포함한다. "실질적으로" 란, 아미
노산 서열 상동성 정도가 적어도 약 85%-95% 인 것을 의미한다. 바람직하게는, 아미노산 서열 상동성 정도
는 90% 초과이고, 더욱 바람직하게는 95% 초과이다.
"메가뉴클레아제" 란, DNA 에서 장 (long) 인지 부위, 길이가 바람직하게는 적어도 12 개, 더욱 바람직하게는
적어도 13 개, 더욱 바람직하게는 적어도 14 개, 더욱 바람직하게는 적어도 15 개, 더욱 바람직하게는 적어도
16 개, 더욱 바람직하게는 적어도 17 개, 및 가장 바람직하게는 적어도 18 개 뉴클레오티드를 인지하는 엔도데
옥시리보뉴클레아제를 의미한다. 메가뉴클레아제는 징크-핑거 뉴클레아제, 천연 발생 귀소 (homing) 엔도뉴
클레아제 및 맞춤 조작된 징크-핑거 뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제를 포함한다. 본 발명에서 사용되도
록 요구하는 것은, 작용적인 돌연변이가 메가뉴클레아제의 작용에 의해 Ig 유전자자리에 도입될 수 있도록, 대
상체 동물에서 내생적 Ig 유전자자리에 또는 그 부근에 존재하는 메가뉴클레아제 타겟 서열을 메가뉴클레아제가
인지하는 것이다. 메가뉴클레아제의 더 자세한 논의를 위해서는, 예를 들어 하기 문헌을 참조한다: U.S. 특
허 출원 공보 제 20060206949 호, 제 20060153826 호, 제 20040002092 호, 제 20060078552 호, 및 제
20050064474 호.
특이성이 변경된 징크-핑거 뉴클레아제는 각각의 징크 핑거들을 상이한 삼중자 타겟과 조합함으로써 생산할 수
있다. 천연 발생 귀소 엔도뉴클레아제의 특이성은 구조를 바탕으로 하는 단백질 공법으로 변경할 수 있다.
예를 들면, 문헌 [Proteus and Carroll, nature biotechnology 23(8):967-97, 2005] 을 참조한다.
"생식계열의 불활성화된 Ig 유전자자리", 또는 "생식계열의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리", 또는 "내생적
Ig 유전자자리 내 생식계열 돌연변이" 를 가진 동물은 모든 세포에서, 즉 모든 체세포 및 생식 세포에서 불활성
화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진다. 본 발명에서, 생식계열의 불활성화된 유전자자리를 가진 동물은, 수
득되는 동물 또는 그의 선조의 근원이 되는 생식 세포에서 메가뉴클레아제의 작용에 의해 초래되는 바와 같이
돌연변이에 의해 생산된다.
불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포 및 트랜스제닉 동물의 생산
본 발명에서, 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 갖는 생존가능한 생식 세포를 생산하도록, 메
가뉴클레아제가 내생적 Ig 유전자자리를 불활성화하는데 사용된다. 그 방법은 생식 세포, 수정된 난모세포
또는 배아에서 적어도 하나의 메가뉴클레아제를 발현시켜 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가
진 생존가능한 생식 세포를 생산하는 것을 포함한다. 그렇게 발현된 메가뉴클레아제는 대상체 동물에서 내
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생적 Ig 유전자자리에 또는 그 부근에 존재하는 메가뉴클레아제 타겟 서열을 인지한다.
메가뉴클레아제가 생식 세포에서 발현되는 한 구현예에서, 메가뉴클레아제가 발현되어진 생식 세포는 적어도 하
나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포를 양산한다. 대안적으로, 적어도 하나
의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포는 메가뉴클레아제가 발현되어진 생식 세포로
부터 유도되는 동물로부터 수득할 수 있다.
메가뉴클레아제가 수정된 난모세포 또는 배아에서 발현되는 한 구현예에서, 적어도 하나의 불활성화된 내생적
Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포는 메가뉴클레아제가 발현되어진 수정된 난모세포 또는 배아에서 유
도되는 동물로부터 수득할 수 있다.
*본 발명은 또한 적어도 하나의 생식계열의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 포함하는 트랜스제닉 동물을 생
산하는 방법도 제공한다. 상기 방법은 본원의 방법에 따라 생산된 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유
전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포로부터 트랜스제닉 동물을 유도하는 것을 포함한다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 갖는 생존가능한 생식 세포는 인공 Ig 유전
자자리를 포함하고, 그렇게 생산된 트랜스제닉 동물은 인공 Ig 유전자자리를 포함한다.
한 구현예에서, 방법은 인공 Ig 유전자자리를 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능
한 생식 세포, 또는 그의 생식 세포 자손 또는 그로부터 유도된 수정된 난모세포 또는 배아에 도입하는 것을 추
가로 포함하며, 그렇게 생산된 트랜스제닉 동물은 인공 Ig 유전자자리를 포함한다.
한 구현예에서, 방법은 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포, 또는 그
의 생식 세포 자손을 인공 Ig 유전자자리를 포함하는 배우자와 조합하는 것을 포함하며, 그렇게 생산된 트랜스
제닉 동물은 인공 Ig 유전자자리를 포함한다.
내생적 Ig 유전자자리의 불활성화
내생적 Ig 유전자자리의 불활성화는, 대상체 동물에서 내생적인 중쇄 및/또는 경쇄 유전자자리에서 면역글로불
린 유전자 단편에 대해 특이적인 메가뉴클레아제를 이용하여 수행된다. 한 구현예에서, 이중 가닥 끊김은
생식 세포, 수정된 난모세포 또는 배아에 메가뉴클레아제를 주입함으로써 유도될 수 있다. 대안으로, 생식
세포, 수정된 난모세포 또는 배아에서 발현될 수 있고 메가뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 또는 발현 벡터를 상
기에 주입할 수 있다.
한 구현예에서, 방법은 생식 세포 (이의 전구체, 예컨대 정조 (spermatagonial) 줄기 세포 등을 포함할 수
있음) 를 시험관 내 또는 생체 내에서 핵산을 인코딩하는 메가뉴클레아제 또는 발현 구축물로 트랜스펙션
(transfection) 하는 것을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Ryu et al., J. Androl., 28:353-360, 2007; Orwig
et al., Biol. Report, 67:874-879, 2002] 을 참조한다.
바람직한 구현예에서, 메가뉴클레아제 발현 구축물은 대상체 동물의 게놈에 혼입된다. 생식 세포에서 메가
뉴클레아제를 인코딩하는 도입유전자 (transgene) 의 발현으로 내생적 Ig 유전자자리에서 이중 가닥 끊김이 야
기되고, 이어서 제한 부위에서 돌연변이가 일어날 것이다. 이러한 트랜스제닉 동물의 짝짓기로 돌연변이된/
불활성화된 면역글로불린 유전자자리를 갖는 자손이 생긴다.
본 발명의 매우 바람직한 구현예에서, 조절가능한 메가뉴클레아제 발현 구축물이 대상체 동물의 게놈에 혼입되
는데, 상기 조절가능한 구축물은 생식 세포에서 유도가능하다. 이러한 구축물은 유도성 프로모터, 예를 들
어 열-유도성 프로모터, 방사선-유도성 프로모터, 테트라사이클린 오페론, 호르몬 유도성 프로모터, 및 트랜스
활성자 (transactivator) 의 이합체화에 의해 유도가능한 프로모터 등을 매개로 조절되는 발현을 통해, 특정 메
가뉴클레아제의 발현과 관련된 세포독성 효과의 최소화를 준비한다. 예를 들어, 문헌 [Vilaboa et al.,
Current Gene Therapy, 6:421-438, 2006] 을 참조한다.
대안적으로, 메가뉴클레아제 발현은 생식 세포에서 유도된 배아에서 유도될 수 있다.
한 구현예에서, 단일 메가뉴클레아제가 생식 세포에서 발현되는데, 이때 메가뉴클레아제는 대상체 동물의 생식
세포에 내생적인 면역글로불린 유전자자리에 또는 그 부근의 타겟 서열을 인지한다. 바람직한 구현예에서,
메가뉴클레아제 타겟 서열은 J 유전자 분절에 또는 그 부근에 존재한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 메
가뉴클레아제 타겟 서열은 면역글로불린 불변 영역 유전자에 또는 그 부근에 존재한다. 바람직한 구현예에
서, 면역글로불린 불변 영역 유전자는 면역글로불린 μ 를 인코딩한다.
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바람직한 구현예에서, 별개의 타겟 서열을 가진 적어도 두 개의 메가뉴클레아제가 사용된다. 적어도 2 개의
메가뉴클레아제는 생식 세포에서 발현되며, 이때 메가뉴클레아제는 대상체 동물의 생식 세포에 내생적인 면역글
로불린 유전자자리에 또는 그 부근의 별개의 타겟 서열을 인지한다.
바람직한 구현예에서, 제 1 및 제 2 의 메가뉴클레아제는 J 유전자 분절을 타겟팅한다. 한 구현예에서, 제
1 및 제 2 의 메가뉴클레아제 타겟 서열은 내생적 Ig 유전자자리 내 하나 이상의 J 유전자 분절의 상류 및 하류
에서 함께 취해져, 제 1 및 제 2 의 인코딩된 메가뉴클레아제가 절단하여 하나 이상의 J 유전자 분절을 포함하
는 게놈 DNA 분절을 결손한다.
또 다른 구현예에서, 제 1 및 제 2 의 메가뉴클레아제는 불변 영역 유전자 분절을 타겟팅한다. 한 구현예에
서, 제 1 및 제 2 의 메가뉴클레아제 타겟 서열은 하나 이상의 면역글로불린 불변 영역 유전자 분절의 상류 및
하류에서 함께 취해져, 제 1 및 제 2 의 인코딩된 메가뉴클라아제가 절단하여 하나 이상의 면역글로불린 불변
영역 유전자 분절을 포함하는 게놈 DNA 분절을 결손한다. 바람직한 구현예에서, 불변 영역 유전자는 면역글
로불린 μ 을 인코딩한다.
한 구현예에서, 전체의 내생적 Ig 중쇄 및/또는 Ig 경쇄 유전자자리, 또는 이의 큰 부분이 대상체 동물의 게놈
으로부터 결손된다. 이러한 동물은 또한 불활성되어진 내생적 유전자자리를 포함하는 것으로서 지칭된다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 메가뉴클레아제가 사용되어 내생적 Ig 중쇄 유전자자리의 CH1 영역을
파괴하면서, 그 유전자자리의 나머지는 그대로 두고 전형적인 면역글로불린 : 샤페론 연합을 우회시키는 Ig 중
쇄를 생산할 수 있다. 바람직하게는, 상기 CH1 타겟팅은 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍된 동물에서
실시된다. 그러한 동물에서 상기 타겟팅은 중쇄 독존의 항체를 생산하는데 유용하다.
한 구현예에서, 하나 초과의 메가뉴클레아제가 Ig 중쇄 유전자자리 내 CH1 을 타겟팅하는데 사용된다.
한 구현예에서, 인접한 부위를 인지하는 두 개의 메가뉴클레아제가 사용된다. 한 구현예에서, 상기 부위는
팔린드롬 (palindrome) 의 요소이다. 한 구현예에서, 두 개의 메가뉴클레아제는 링커 (linker) 에 의해 결
박되어 있다.
바람직한 구현예에서, 사용되는 번식 전략은 내생적 Ig 경쇄 및/또는 내생적 Ig 중쇄에 있어서 무접합형인 동물
을 수득하는 것으로 고안되어 있다.
조절가능한 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 포함하는 트랜스제닉 동물
한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 조절가능한 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 포함하는 트랜스제닉 동
물을 제공한다.
트랜스제닉 동물은 작은 실험실 동물, 특히 조류 (닭, 칠면조, 메추라기, 오리, 꿩 또는 거위 등), 설치류 (예
를 들어, 래트, 햄스터 및 기니 피그), 및 족제비류 (예를 들어, 흰족제비) 로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 조절가능한 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물은 메가뉴클레아제-인코딩 핵산에 작동적으
로 연결된 유도성 발현 조절 영역을 포함한다. 유도성 발현 조절 영역은 특정 트랜스제닉 동물의 생식 세포
에서 유도적으로 작용적이며, 인코딩된 메가뉴클레아제는 대상체 동물의 내생적 면역글로불린 유전자자리에 또
는 그 부근에 위치된 메가뉴클레아제 타겟 서열에 대해서 선택적이다.
조절가능 메가뉴클레아제 발현 구축물은, 유도성 프로모터, 예를 들어, 열-유도성 프로모터, 방사선-유도성 프
로모터, 테트라사이클린 오페론, 호르몬 유도성 프로모터, 및 트랜스활성자의 이합체화에 의해 유도가능한 프로
모터 등을 매개로 조절된 발현을 통해, 특정 메가뉴클레아제의 발현과 연관된 세포독성 효과의 최소화를 대비한
다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 트랜스제닉 동물은 2 개의 별개의 타겟 서열을 인지하는 2 개의 별개의 메가뉴
클레아제를 인코딩하는 2 개의 별개의 핵산을 포함하는 2 개의 조절가능 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 포
함한다. 상기 2 개의 메가뉴클레아제는 조합되어 내생적 Ig 유전자자리의 게놈 DNA 분절을 결손시키도록 작
용되며 이로써 이를 불활성화시킨다.
적어도 하나의 조절가능 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 포함하는 트랜스제닉 동물은, 당업계에 익히 공지
된 방법으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 메가뉴클레아제-인코딩 핵산에 작동적으로 연결된 유도성 발현 조
절 영역을 포함하는 트랜스제닉 벡터가 수용자 세포 또는 세포들에 도입될 수 있고, 그 다음에 무작위 혼입에
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의해 또는 타겟팅된 혼입에 의해 상기 수령자 세포 또는 세포들의 게놈에 혼입될 수 있다.
무작위 혼입에 있어서, 그러한 트랜스제닉 벡터는 표준 트랜스제닉 기술에 의해 수령자 세포에 도입될 수 있다.
예를 들어, 트랜스제닉 벡터를 수정된 난모세포의 전핵 (pronucleus) 에 직접 주입할 수 있다. 트랜스제
닉 벡터는 또한 난모세포 수정 전 트랜스제닉 벡터를 가진 정자의 공동-인큐베이션 (co-incubation) 에 의해 도
입될 수 있다. 트랜스제닉 동물은 수정된 난모세포로부터 발생될 수 있다. 트랜스제닉 벡터를 도입하는
또 다른 방법은 배아 줄기 세포 또는 기타 다능성 세포 (예를 들어 원시 생식 세포) 를 트랜스펙션한 다음 후속
해서 유전자 조작된 세포를 발달 중인 배아에 주입하는 것에 의한 것이다. 대안적으로, 트랜스제닉 벡터 (나
상 (naked) 또는 촉진 시약과 조합) 를 발달중인 배아에 직접 주입할 수 있다. 또 다른 구현예에서는, 트랜
스제닉 벡터가 세포 게놈에 도입되어, 동물이 핵 이식 클로닝에 의해 트랜스펙션된 세포로부터 유도된다.
타겟팅된 혼입에 있어서, 상기 트랜스제닉 벡터는 배아 줄기 세포 또는 이미 분화된 체세포와 같은 적절한 수령
자 세포로 도입될 수 있다. 후에, 도입유전자가 상동 재조합으로 타겟팅된 부위에서 동물 게놈에 혼입되어
있는 세포를 표준 방법으로 선택할 수 있다. 이때, 선택된 세포는 제핵된 핵 이식 단위 세포, 예를 들어 난
모세포 또는 배아 줄기 세포, 전능성 (totipotent) 이고 작용적 신생아를 형성할 수 있는 세포와 융합될 수 있
다. 융합은 익히 확립된 종래의 기술에 따라 수행된다. 예를 들어, 문헌 [Cibelli et al., Science
(1998) 280:1256 Zhou et al. Science (2003) 301 : 1179] 을 참조한다. 난모세포의 제핵 및 핵 이식이 또
한 주입 피펫을 이용해 미세수술로 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Wakayama et al., Nature (1998)
394:369] 을 참조한다.) 이어서, 수득한 세포를 적절한 배지에서 배양하고, 이를 트랜스제닉 동물을 생산하
기 위해 동기화된 (synchronized) 수령자에 이동한다. 대안적으로는, 선택된 유전자 조작된 세포를 발달중
인 배아에 주입할 수 있다.
한 구현예에서, 메가뉴클레아제를 사용해 타겟 부위에서 이중-가닥 DNA 절단을 통한 상동 재조합의 빈도를 증가
시킨다.
인공 Ig 유전자자리를 포함하고, 인간 이디오타입을 가진 항체를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물
한 측면에서, 본 발명은 인간 이디오타입을 가진 면역글로불린을 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 및 이의 생산
방법을 제공한다.
사용된 트랜스제닉 동물은 특히 조류 (닭, 칠면조, 메추라기, 오리, 꿩 또는 거위 등), 설치류 (예를 들어, 래
트, 햄스터 및 기니 피그), 및 족제비류 (예를 들어, 흰족제비) 로부터 선택된다.
본 발명에서 인간화 항체 생산에 사용되는 트랜스제닉 동물은 하나 이상의 메가뉴클레아제의 활성에 의해 초래
되는 내생적 Ig 유전자자리 내 생식계열 돌연변이를 지닌다. 바람직한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 내생
적 Ig 중쇄 및/또는 내생적 Ig 경쇄에 있어서 무접합형이다. 게다가, 이들 동물은 트랜스제닉 동물에서 작
용적이고 면역글로불린 분자의 레퍼토리를 만들 수 있는 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 가진다. 본
발명에서 사용되는 인공 Ig 유전자자리는 적어도 하나의 인간 V 유전자 분절을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리 및 적어도 하나의 인공 Ig 경
쇄 유전자자리를 보유하는데 이는 각각 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 면역글로불린 분자의 레퍼토리를 만들
수 있으며, 상기 면역글로불린 분자의 레퍼토리는 인간 이디오타입을 가진 항체를 포함한다. 한
구현예에서, 적어도 하나의 비인간 C 유전자를 포함하는 인공 유전자자리가 사용되고, 인간 이디오타입 및 비인
간 불변 영역을 가진 키메라 항체를 생산할 수 있는 동물이 제공된다. 한 구현예에서, 적어도 하나의 인간
C 유전자를 포함하는 인공 유전자자리가 사용되고, 및 인간 이디오타입 및 인간 불변 영역을 가진 항체를 생산
할 수 있는 동물이 제공된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 보유하며, 작용적
인 Ig 경쇄 유전자자리는 결핍되어 있다. 이러한 동물은 중쇄 독존의 항체의 생산에서 유용한 것으로 보인
다.
이러한 트랜스제닉 동물의 생산에는, 하나 이상의 인공 중쇄 Ig 유전자자리 및 하나 이상의 인공 경쇄 Ig 유전
자자리를, 하나 이상의 메가뉴클레아제의 작용에 의해 불활성화되었거나 또는 될 수 있는 적어도 하나의 내생적
Ig 유전자자리를 가진 트랜스제닉 동물의 게놈으로의 혼입이 포함된다. 바람직하게는, 트랜스제닉 동물은
내생적 Ig 중쇄 및/또는 내생적 Ig 경쇄에 있어서 무접합형이며, 그에 따라 내생적 면역글로불린을 생산할 수
없다. 염색체 위치와 관계없이, 본 발명의 인공 Ig 유전자자리는 유전자 재배열을 행할 역량이 있어, 이로
인해 면역글로불린 분자의 다각화된 레퍼토리를 만든다. 유전자 재배열을 행할 역량을 가진 Ig 유전자자리
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는 또한 "작용적인" Ig 유전자자리로서 본원에서 지칭되며, 이 작용적인 Ig 유전자자리에 의해 생산된 다양한
항체가 또한 본원에서 "작용적인" 항체 또는 "작용적인" 항체 레퍼토리로 지칭된다.
상기 트랜스제닉 동물을 생산하는데 사용되는 인공 유전자자리는 각각 다수의 면역글로불린 유전자 분절을 포함
하는데, 이는 적어도 하나의 V 영역 유전자 분절, 하나 이상의 J 유전자 분절, 하나 이상의 D 유전자 분절 (중
쇄 유전자자리의 경우임) 및 하나 이상의 불변 영역 유전자를 포함한다. 본 발명에서, V 유전자 분절 중 적
어도 하나는 생식계열 또는 초돌연변이된 인간 V-영역 아미노산 서열을 인코딩한다. 따라서, 이러한 트랜스
제닉 동물은 인간 이디오타입을 가진 항체를 포함하는, 면역글로불린 분자의 다각적인 레퍼토리를 만들 수 있는
역량을 지닌다.
한 구현예에서, 사용된 인공 유전자자리는 적어도 하나의 비인간 C 영역 유전자 분절을 포함한다. 따라서,
이러한 트랜스제닉 동물은 인간 이디오타입을 가진 키메라 항체를 포함하는 면역글로불린 분자의 다각적인 레퍼
토리를 만들 역량을 지닌다.
한 구현예에서, 사용된 인공 유전자자리는 적어도 하나의 인간 C 영역 유전자 분절을 포함한다. 따라서, 이
러한 트랜스제닉 동물은 인간 이디오타입 및 인간 불변 영역을 가진 항체를 포함하는 면역글로불린 분자의 다각
적인 레퍼토리를 만들 역량을 지닌다.
한 구현예에서, 사용된 인공 유전자자리는 적어도 하나의 인공 불변 영역 유전자를 포함한다. 예를 들어,
예시의 인공 C 불변 영역 유전자는, 인간 IgG CH1 도메인 및 래트 IgG CH2 및 CH3 도메인을 인코딩하는 불변 영
역 유전자이다. 따라서, 이러한 트랜스제닉 동물은 면역글로불린 분자의 다각적인 레퍼토리를 만들 역량을
지니며, 이는 인간 성분 및 비인간 성분 모두를 포함하는 인공 불변 영역 및 인간 이디오타입을 가진 항체를 포
함한다.
인공 Ig 유전자자리를 포함하는 트랜스제닉 벡터는 수령자 세포 또는 세포들에 도입한 다음, 무작위 혼입 또는
타겟팅된 혼입에 의해 수령자 세포 또는 세포들의 게놈에 혼입된다.
무작위 혼입에 있어서, 인공 Ig 유전자자리를 포함하는 트랜스제닉 벡터는 표준 트랜스제닉 기술에 의해 수령자
세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 트랜스제닉 벡터를 수정된 난모세포의 전핵에 직접 주입할 수 있다.
트랜스제닉 벡터는 또한 난모세포 수정 전 트랜스제닉 벡터를 가진 정자의 공동-인큐베이션에 의해 도입될 수
있다. 트랜스제닉 동물은 수정된 난모세포로부터 발달할 수 있다. 트랜스제닉 벡터를 도입하는 또 다른
방법은 배아 줄기 세포 또는 기타 다능성 세포 (예를 들어 원시 생식 세포) 를 트랜스펙션한 다음 후속해서 유
전자 조작된 세포를 발달 중인 배아에 주입하는 것에 의한 것이다. 대안적으로, 트랜스제닉 벡터 (나상 또는
촉진 시약과 조합됨) 를 발달중인 배아에 직접 주입할 수 있다. 결국, 키메라 트랜스제닉 동물은 적어도 일
부의 트랜스제닉 동물 체세포의 게놈에 혼입된 인공 Ig 도입유전자를 포함하는 배아로부터 생산된다. 또 다
른 구현예에서는, 트랜스제닉 벡터가 세포 게놈에 도입되어, 동물이 핵 이식 클로닝에 의해 트랜스펙션된 세포
로부터 유도된다.
바람직한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리를 포함하는 도입유전자는 수령자 세포 (예컨대 수정된 난모세포 또는
발달 중인 배아) 의 게놈에 무작위로 혼입된다. 수령자 세포는 하나 이상의 메가뉴클레아제의 작용에 의해
불활성화되어져 있는 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리를 가진 동물에서 유도된다. 대안적으로, 인공 면
역글로불린 유전자자리를 보유한 트랜스제닉 동물은 하나 이상의 메가뉴클레아제의 작용에 의해 불활성화되어져
있는 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리를 가진 트랜스제닉 동물과 교배될 수 있다. 사용된 특정 방법과
는 관계없이, 바람직한 구현예에서, 내생적 Ig 중쇄 및/또는 Ig 경쇄에 있어서 무접합형이고 따라서 내생적 면
역글로불린을 생산할 수 없고, 트랜스제닉 면역글로불린을 생산할 수 있는 자손이 수득된다.
타겟팅된 혼입에 있어서, 트랜스제닉 벡터는 배아 줄기 세포, 기타 다능성 세포 또는 이미 분화된 체세포와 같
은 적절한 수령자 세포로 도입될 수 있다. 후에, 도입유전자가 상동 재조합으로 동물 게놈에 혼입되어, 해
당 내생적 Ig 유전자자리를 대체한 세포가 표준 방법으로 선택될 수 있다. 이때 선택된 세포는 제핵된 핵
이식 단위 세포, 예를 들어 난모세포 또는 배아 줄기 세포, 전능성이고 작용적 신생아를 형성할 수 있는 세포와
융합될 수 있다. 융합은 익히 확립된 종래의 기술에 따라 수행된다. 예를 들어, 문헌 [Cibelli et al.,
Science (1998) 280:1256; Zhou et al. Science (2003) 301 : 1179] 을 참조한다. 난모세포의 제핵 및 핵
이식이 또한 주입 피펫을 이용해 미세수술로 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Wakayama et al., Nature
(1998) 394:369] 을 참조한다.) 이어서, 수득한 세포를 적절한 배지에서 배양하고, 이를 트랜스제닉 동물을
생산하기 위해 동기화된 수령자에 이동한다. 대안적으로는, 선택된 유전자 조작된 세포를, 발달 중인 배아
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에 주입할 수 있으며, 이를 후속해서 키메라 동물 내로 발달시킨다.
한 구현예에서, 메가뉴클레아제를 사용해 타겟 부위에서 이중 가닥 DNA 절단을 통한 상동 재조합의 빈도를 증가
시킨다. 내생적 면역글로불린 유전자자리로의 혼입을 위해, 부위 특이적 메가뉴클레아제를 사용할 수 있다.
한 구현예에서, 내생적 Ig 유전자자리를 타겟팅하는 메가뉴클레아제를 사용하여, 내생적 Ig 유전자자리 또는
그의 일부를 인공 Ig 유전자자리 또는 그의 일부로 상동 재조합 및 대체하는 빈도를 증가시킨다.
한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍되어 있고, 인공 Ig 중쇄 유전자자리를
포함한다.
인공 Ig 유전자자리
본 발명은 인공 Ig 유전자자리, 및 인간 이디오타입을 가진 면역글로불린을 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물의
생산에서 상기 인공 Ig 유전자자리의 용도에 관한 것이다.
각각의 인공 Ig 유전자자리는 다수의 면역글로불린 유전자 분절을 포함하는데, 이는 적어도 하나의 V 영역 유전
자 분절, 하나 이상의 J 유전자 분절, 하나 이상의 D 유전자 분절 (중쇄 유전자자리의 경우임), 및 하나 이상의
불변 영역 유전자를 포함한다. 본 발명에서, V 유전자 분절 중 적어도 하나는 생식계열 또는 초돌연변이된
인간 V-영역 아미노산 서열을 인코딩한다. 따라서, 상기 트랜스제닉 동물은 면역글로불린 분자의 다각화된
레퍼토리를 만들 수 있는 역량을 지니는데, 여기에는 인간 이디오타입을 가진 항체가 포함된다. 중쇄 유전
자자리에서, 인간 또는 비인간-유래의 D-유전자 분절이 인공 Ig 유전자자리에 포함될 수 있다. 그러한 유전
자자리에서 상기 유전자 분절은 서로 간 재배열되지 않은 배위 (또는 "생식 계열 배위") 또는 부분적 또는 완전
히 재배열된 배위로 나란히 놓여진다. 인공 Ig 유전자자리는 대상체 동물에서 유전자 재배열 (유전자 분절
이 완전히 재배열되지 않은 경우임) 을 행하는 역량을 가지므로 인간 이디오타입을 가진 면역글로불린의 다각화
된 레퍼토리를 만든다.
프로모터, 인핸서, 스위치 영역, 재조합 신호 등과 같은 조절 요소는 인간 또는 비인간 기원일 수 있다. 요
구되는 것은 인공 유전자자리가 작용적이 되도록, 상기 요소가 관심 동물종에서 작동가능해야 하는 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 숙주 동물에서 유전자 재배열을 행할 수 있어 인간 이디오타입을 가진 중쇄의 다각화된
레퍼토리를 만들 수 있는 인공 중쇄 유전자자리를 포함하는 트랜스제닉 구축물을 제공한다. 도입유전자의
인공 중쇄 유전자자리는 적어도 하나의 인간 V 유전자 분절을 가진 V-영역을 포함한다. 바람직하게는, V-영
역은 적어도 약 5-100 인간 중쇄 V (또는 "VH") 유전자 분절을 포함한다. 상기에서 기술한 바와 같이, 인간
VH 분절은 인간 VH 유전자 분절의 천연 발생 서열, 인간 VH 유전자 분절의 천연 발생 서열의 변성형뿐 아니라
인간 중쇄 V 도메인 폴리펩티드와 실질적으로 (즉, 적어도 약 85%-95%) 동일한 폴리펩티드 서열을 인코딩하는
합성 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 인공 중쇄 유전자자리는 적어도 하나의 또는 수 개의 래트 불변 영역 유전자, 예를 들어,
Cδ, Cμ 및 Cγ (Cγ 하부부류의 임의의 것 포함) 를 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 인공 중쇄 유전자자리는 인공 불변 영역 유전자를 포함한다. 바람직한 구현
예에서, 상기 인공 불변 영역 유전자는 인간 CH1 도메인 및 래트 CH2 CH3 도메인, 또는 인간 CH1 및 래트 CH2,
CH3 및 CH4 도메인을 인코딩한다. 인간 CH1 도메인을 가진 하이브리드 중쇄는 효과적으로 완전한 인간 경쇄
와 쌍을 이룬다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 인공 중쇄 유전자자리는 CH1 도메인이 결핍된 인공 불변 영역 유전자를
포함한다. 바람직한 구현예에서, 이러한 인공 불변 영역 유전자는, CH1 도메인은 결핍되나, CH2, 및 CH3,
또는 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인을 포함하는, 끝이 잘린 (truncated) IgM 및/또는 IgG 를 인코딩한다.
CH1 도메인이 결핍된 중쇄는 Ig 경쇄와 효과적으로 쌍을 이룰 수 없어, 중쇄 독존의 항체를 형성한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 동물에서 유전자 재배열을 행할 수 있어, 인간 이디오타입을 가진 경쇄의 다
각화된 레퍼토리를 만들 수 있는 인공 경쇄 유전자자리를 포함하는 트랜스제닉 구축물을 제공한다. 도입유
전자의 인공 경쇄 유전자자리는 적어도 하나의 인간 V 유전자 분절을 가진 V-영역, 예를 들어, 적어도 하나의
인간 VL 유전자 및/또는 적어도 하나의 재배열된 인간 VJ 분절을 가진 V-영역을 포함한다. 바람직하게는,
V-영역은 적어도 약 5-100 인간 경쇄 V (또는 "VL") 유전자 분절을 포함한다. 시종일관하여, 인간 VL 분절
은 인간 VL 유전자 분절의 천연 발생 서열, 인간 VL 유전자 분절의 천연 발생 서열의 변성형뿐 아니라, 인간 경
쇄 V 도메인 폴리펩티드와 실질적으로 (즉, 적어도 약 85%-95%) 동일한 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 합성 서
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열을 포함한다. 한 구현예에서, 인공 경쇄 Ig 유전자자리는 적어도 하나의 래트 C 유전자를 가진 C-영역
(예를 들어, 래트 Cλ 또는 Cκ) 을 가진다.
본 발명의 또다른 측면은 인공 Ig 유전자자리를 포함하는 트랜스제닉 벡터를 생산하는 방법에 관한 것이다.
이러한 방법은, Ig 유전자자리 또는 이의 단편을 단리하고, 이를 인간 V 영역 요소를 인코딩하는 서열을 포함
하는 1 또는 수 개의 DNA 단편과 조합하는 것을 포함한다. Ig 유전자 분절(들)은, 인공 Ig 유전자자리 또는
그의 부분에, 결찰 또는 상동 재조합에 의해, 상기 유전자자리가 대상체 동물에서 유효한 유전자 재배열을 행하
는 역량을 보유하도록 하는 방식으로 삽입된다.
바람직하게는, 비인간 Ig 유전자자리는, 이의 게놈 DNA 로부터 제조된, 플라스미드, 코스미드, YAC 또는 BAC,
등의 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리된다. YAC 클론은 2 이하의 메가염기 (megabase) 의 DNA 단편을
가질 수 있어, 전체의 동물 중쇄 유전자자리 또는 그의 큰 부분은 하나의 YAC 클론에서 단리될 수 있거나 또는
하나의 YAC 클론에 함유되도록 재구축될 수 있다. BAC 클론은 더 작은 크기 (약 50 ~ 500 kb) 의 DNA 단편
을 가질 수 있다. 그러나, Ig 유전자자리의 중복 단편들을 포함하는 다수의 BAC 클론들은 따로따로 변경될
수 있고 이후에 동물 수령자 세포 내로 함께 주입될 수 있는데, 이때 중복 단편들은 수령자 동물 세포에서 재조
합되어 연속의 Ig 유전자자리를 형성한다.
인간 Ig 유전자 분절은 상동 재조합을 통해서 DNA 단편들의 결찰 또는 DNA 단편들의 삽입을 포함하는 각종 방법
으로 벡터 (예를 들어 BAC 클론) 상에 Ig 유전자자리로 혼입될 수 있다. 인간 Ig 유전자 분절의 혼입은, 인
간 Ig 유전자 분절이 도입유전자에서 숙주 동물 서열과 작동적으로 연결되어 작용적인 인간화 Ig 유전자자리,
즉 인간 이디오타입을 가진 항체의 다각화된 레퍼토리의 제작을 이끄는 유전자 재배열을 행할 수 있는 Ig 유전
자자리를 생산하는 방식으로 수행된다. 상동 재조합이 높은 빈도로 일어나는 박테리아, 효모 및 기타 세포
에서 상동 재조합은 수행할 수 있다. 조작된 YAC 및 BAC 는 세포에서 용이하게 단리될 수 있으며 트랜스제
닉 동물을 생산하는데 사용될 수 있다.
인간 이디오타입이 있는 면역글로불린
인간 이디오타입을 가진 면역글로불린을 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물이 일단 만들어지면, 상기 동물을 항원
으로 면역화시켜 항원에 대항하는 면역글로불린 및 항체 제제를 용이하게 수득할 수 있다. 본원에서 사용되
는 바와 같은 "다클론 항혈청 조성물" 은 친화도 정제된 다클론 항체 제제를 포함한다.
각종 항원이 트랜스제닉 동물을 면역화하는데 사용될 수 있다. 이러한 항원에는 미생물, 예를 들어 바이러
스 및 단세포 유기체 (예컨대 박테리아 및 진균류), 살아있는, 약독화 또는 죽은 미생물 단편, 또는 미생물에서
단리된 항원성 분자가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
동물을 면역화하는데 사용되기에 바람직한 박테리아성 항원은, 황색포도구균 (Staphylococcus aureus), 예컨대
협막 다당류 유형 5 및 8, 알파 독소의 정제된 항원, 부착소 결합 단백질, 콜라겐 결합 단백질, 및 섬유결합소
결합 단백질 등의 독력 인자의 재조합 버젼을 포함한다. 바람직한 박테리아성 항원은 또한 황색포도구균,
녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), 장내구균 (enterococcus), 장내세균 (enterobacter), 및 폐렴막대균
(Klebsiella pneumoniae), 또는 이들 박테리아 세포의 배양 상청액의 약독화 버젼을 포함한다. 면역화에 사
용될 수 있는 기타 박테리아성 항원은, 정제된 지질다당류 (LPS), 협막 항원, 협막 다당류 및/또는 녹농균, 장
내구균, 장내세균, 및 폐렴막대균의 내독소 및 외독소, 외막 단백질, 섬유결합소 결합 단백질의 재조합 버젼을
포함한다.
진균류에 대한 항체 생산을 위한 바람직한 항원은 진균류 또는 그의 외막 단백질의 약독화 버젼을 포함하며, 상
기 진균류는 이에 제한되는 것은 아니나, 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 칸디다 파라프실로시스
(Candida parapsilosis), 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis), 및 크립토코쿠스 네오포르만스
(Cryptococcus neoformans) 를 포함한다.
바이러스에 대항하는 항체를 생산하기 위해서 면역화에서 사용하기에 바람직한 항원은, 호흡기세포융합 바이러
스 (RSV) (특히 F-단백질), C 형 간염바이러스 (HCV), B 형 간염바이러스 (HBV), 거대세포바이러스 (CMV),
EBV, 및 HSV 를 포함하나 이에 제한되지 않는 바이러스의 약독화 버젼 및 외피 단백질을 포함한다.
암에 대해 특이적인 항체는, 단리된 종양 세포 또는 종양 세포주뿐 아니라, 이에 제한되는 것은 아니나 Her-2-
neu 항원 (유방암 치료에 유용한 항체에 대한 것); CD20, CD22 및 CD53 항원 (B 세포 림프종 치료에 유용한 항
체에 대한 것), 전립선 특이 막 항원 (PMSA) (전립선암 치료에 유용한 항체에 대한 것) 및 17-1A 분자 (결장암
치료에 유용한 항체에 대한 것) 를 포함하는 종양과 관련된 항원으로 트랜스제닉 동물을 면역화함으로써 생산할
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수 있다.
항원은 임의의 편리한 방법으로 애쥬번트 (adjuvant) 와 함께 또는 없이 트랜스제닉 동물에 투여될 수 있으며,
미리 예정된 스케쥴에 따라 투여될 수 있다.
단일클론 항체를 만들기 위해서는, 비장 세포를 면역화된 트랜스제닉 동물에서 단리하고, 형질전환된 세포주와
세포융합시켜 하이브리도마 생산을 하여 사용하거나, 또는 항체를 인코딩하는 cDNA 를 표준 분자 생물 기술로
클로닝해 트랜스펙션된 세포에서 발현시킨다. 단일클론 항체 생산 절차는 당업계에 익히 확립되어 있다.
예를 들어, 유럽 특허 출원 0 583 980 A1 ("Method For Generating Monoclonal Antibodies From Rabbits"),
U.S. 특허 No. 4,977,081 ("Stable Rabbit-Mouse Hybridomas And Secretion Products Thereof), WO 97/16537
("Stable Chicken B-cell Line And Method of Use Thereof), 및 EP 0491 057 B1 ("Hybridoma Which Produces
Avian Specific Immunoglobulin G") 을 참조하는데, 이들 문헌의 개시물은 본원에서 참조인용되고 있다.
클로닝된 cDNA 분자로부터 단일클론 항체의 시험관 내 생산은 문헌 [Andris-Widhopf et al., "Methods for the
generation of chicken monoclonal fragments by phage display", J Immunol Methods 242:159 (2000)], 및 문
헌 [Burton, D. R., "Phage display", Immunotechnology 1:87 (1995)] 에 기술되어 있다.
일단 인간 이디오타입을 가진 키메라 단일클론 항체가 생산되면, 이러한 키메라 항체는 표준 분자 생물학 기술
을 이용하여 완전한 인간 항체로 용이하게 전환될 수 있다. 완전한 인간 단일클론 항체는 인간 내에서는 면
역원성이지 않아, 인간 대상체의 치료학적 치료에 사용하기에 적당하다.
본 발명의 항체는 중쇄 독존의 항체를 포함한다.
한 구현예에서, 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍되어 있고 인공 중쇄 유전자자리를 포함하는 트랜스제닉 동
물을 항원으로 면역화시켜, 항원에 특이적으로 결합하는 중쇄 독존의 항체를 생산한다.
한 구현예에서, 본 발명은 상기 동물로부터 유래되는 단일클론 항체를 생산하는 세포 또한 이로부터 유래된 핵
산을 제공한다. 또한, 이로부터 유래된 하이브리도마를 제공한다. 또한, 완전한 인간의 중쇄 독존의 항
체, 및 이로부터 유래된, 상기의 인코딩 핵산을 제공한다.
중쇄 독존의 항체에 대한 교시는 당업계에서 발견된다. 예를 들어, PCT 공보 WO02085944, WO02085945,
WO2006008548, 및 WO2007096779 를 참조한다. 또한 US 5,840,526; US 5,874,541 ; US 6,005,079; US
6,765,087; US 5,800,988; EP 1589107; WO 9734103; 및 US 6,015,695 를 참조한다.
약학적 조성물
본 발명의 추가 구현예에서, 정제된 단일클론 또는 다클론 항체는 환자에게 투여하기에 적합한 적절한 약학적
담체와 함께 혼합되어 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물로 치료되는 환자는, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간이나, 수의과적
용도도 또한 고려된다.
본 약학적 조성물에서 활용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체는 임의의 및 모든 용매, 분산매질, 등장제
등일 수 있다. 임의의 통상적인 매질, 시약, 희석제 또는 담체가 수령자에 또는 그 안에 포함된 항체의 치
료학적 유효성에 불리한 경우를 제외하고는, 본 발명의 약학적 조성물 내에서 이를 사용하는 것은 적절하다.
담체는 액체, 반-고체, 예를 들어 페이스트 또는 고체 담체일 수 있다. 담체의 예는 오일, 물, 염수액, 알
코올, 당, 겔, 지질, 리포좀, 수지, 다공성 매트리스, 결합제, 충전제, 코팅제, 보존제 등 또는 이들의 조합을
포함한다.
치료 방법
본 발명의 추가 측면에서, 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 바람직하게는 영장류 (인간 대상체가 특히 바람직
한 구현예임) 의 질병을 치료하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 그러한 질병을 치료하기에 적합한 본 발명의
정제된 항체 조성물의 투여에 의한 것이다.
항체 조성물은 질병을 일으키거나 또는 그의 원인이 되거나, 또는 바람직하지 않거나 또는 비정상인 면역반응을
도출하는 인간 신체 조직에서 항원체에 결합하여, 중화 또는 조절하는데 사용될 수 있다. "항원체" 는 본원
에서 단백질을 포함하는 임의의 가용성 또는 세포 표면 결합형 분자뿐 아니라 적어도 항체에 결합할 수 있고,
바람직하게는 또한 면역 반응을 자극할 수도 있는 세포 또는 감염병-유발 유기체 또는 시약을 포함하는 것으로
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정의된다.
단일요법으로서 또는 화학요법과 병용되는 감염체에 대한 항체 조성물의 투여로, 감염 입자는 제거된다. 항
체의 단일 투여는 다수의 감염 입자를 일반적으로 10 내지 100 배, 더욱 통상적으로는 1000 배 초과로 감소시킨
다. 마찬가지로, 단일요법으로서 또는 화학요법과 병용되어 활용되는 악성 질환을 앓고 있는 환자에 있어서
항체 요법은 다수의 악성 세포를 일반적으로 10 내지 100 배, 또는 1000 배 초과로 감소시킨다. 감염 입자,
악성 세포 등의 완전한 제거를 확신하도록 충분한 시간에 걸쳐서 요법을 반복할 수 있다. 몇몇의 사례에서
는, 항체 제제를 이용한 요법은, 감염 입자 또는 바람직하지 않은 세포가 검출되지 않은 채 연장된 시간 기간
동안 계속될 것이다.
마찬가지로, 면역 반응의 조절을 위한 항체 요법의 이용은 치료학적 항체의 단일 또는 다중 투여로 이루어질 수
있다. 요법은 임의의 질병 증상 부재 하에서 연장된 시간 기간 동안 계속될 수 있다.
대상체 치료는 감염병 또는 악성종양을 억제하기에 충분한 투약으로 화학요법과 함께 활용될 수 있다. 자가
면역 질환 환자 또는 이식 수령자에 있어서, 항체 요법은 면역 반응을 억제하기에 충분한 투약으로 면역억제 요
법과 함께 활용될 수 있다.
모든 인용문은 그 전체가 본원에서 참조로 명백하게 삽입되었다.
[실시예]
실험
래트 면역글로불린 서열에 특이적인 귀소 엔도뉴클레아제의 유도된 진화
래트 IgM 엑손 서열을 분석하여, 조작된 귀소 엔도뉴클레아제에 대한 여러 타겟 절단 서열을 확인하였다.
귀소 엔도뉴클레아제 I-Scel 을 이용하여, 두 개의 타겟 서열을 동정하였는데, 그 중 하나는 래트 IgM 엑손 II
(CGTGGATCACAGGGGTCT) 내에 있었고, 나머지 하나는 래트 IgM 엑손 III (CTGGGATAACAGGAAGGA) 내에 있었다.
이들 부위는 I-Scel 의 천연 인지 서열 (TAGGGATAACAGGGTAAT) 과 61% (18 개의 염기 중 11 개) 서열 상동성을
공유한다.
표 1. 래트 IgM 엑손 내 타겟 서열 (상이한 뉴클레오티드는 밑줄 그음)
이들 타겟 서열에 대해 특이적인 귀소 엔도뉴클레아제의 조작에 있어서, 본 출원인은 효소 DNA 절단물을 살아
있는 숙주 세포와 결합하는 귀소 엔도뉴클레아제의 유도된 진화를 위해 매우 민감한 선택을 이용했다 (Chen 및
Zhao 의 문헌 "Nucleic Acid Research 33(18):e154, 2005 "에 자세히 기술됨). 시험관 내 공진화
(coevolution) 전략을 사용하여, 타겟 서열 특이성을 지닌 I-Scel 변이체를 조작했다. 표 2 에서 보듯이,
타겟 서열 T3 을 위해서, 두 개의 새로운 서열, 즉 T3i1 및 T3i2 를 중간체 서열로서 선택하였으며, 한편 타겟
서열 T4 를 위해서는, 두 개의 새로운 서열 T4i1 및 T4i2 를 중간체 서열로 선택하였다. T3i1 및 T4i1 서열
을 리포터 플라스미드로 클로닝하여 p11-LacY-T3i1 및 p11-LacY-T4i1 를 각각 수득하였다.
표 2. 3 단계에서의 서열 (상이한 뉴클레오티드는 밑줄 그음)
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T3i1 또는 T4i1 서열 특이성을 지닌 I-Scel 돌연변이를 수득하기 위해, 분자 모형화를 먼저 실시하여, 사용되는
잔기를 동정하였고, 포화 변이유발 (saturation mutagenesis) 을 통해 포커싱된 라이브러리를 만들었다. 도
2 에서 보듯이, I-Scel 은 DNA 의 작은 홈 (minor groove) 에 놓인 느슨한 루프 (loop) 를 통해 T3i1 또는
T4i1 의 3' 말단에 결합한다. 잔기 Gly13, Pro14, Asn15 및 Lys20 는 상기 3' 말단에 가깝고, Asn15 은 야
생형 인지 서열의 3' 말단에서 마지막 티민에 수소 결합을 통해 직접 결합한다. 이들 4 개의 선택된 잔기에
서 가능한 모든 아미노산 치환 조합물을 포함하는 돌연변이의 라이브러리를 포화 변이유발을 통해 구축하였다.
충분히 큰 라이브러리를 생산하기 위해, 수 회의 시도를 거쳐 결찰 반응 및 DNA 형질전환 절차를 최적화하였
다. 2.9 10
6
돌연변이로 이루어진 라이브러리를 만들었다.
T3i1 서열에 대해 활성이 증가된 I-Scel 돌연변이에 대해서, 라이브러리를 스크리닝했다. 라운드 O (야생형
I-Scel) 과 비교했을 때, 제 1 라운드의 스크리닝은 세포 생존률이 10 배 증가하였기 때문에 T3i1 서열에 대한
활성이 증가한 돌연변이를 나타내었다. 라운드 2 및 3 에서 잠재적으로 양성인 돌연변이의 보강으로 세포
생존률에서의 추가 개선을 보였다. 마찬가지로, T4i1 서열에 대한 활성이 증가된 I-Scel 돌연변이에 대해
라이브러리를 스크리닝했다. 돌연변이의 스크리닝 결과 T4i1 서열에 대해 활성이 증가된 돌연변이를 수득했
다.
병행하여, 인지 서열의 5' 말단을 타겟팅하는 I-Scel 돌연변이의 제 2 의 라이브러리를 고안했다. 포화 변
이유발을 이용해 생산된 제 1 의 라이브러리를 I-Scel 인지 서열의 4 개의 뉴클레오티드의 3'말단과 상호작용하
는 잔기들 상에 포커싱하였다. 분자 모형을 기반으로 하면, Trp149, Asp150, Tyr151 및 Asn152 은 5'말단
뉴클레오티드에 의해 형성된 큰 홈 (major groove) 에 놓여 있다. Asn152 은 수소 결합을 통해 T(-7) 과
직접 상호작용한다. Asp150 및 Tyr152 는 물 분자를 통해 간접적으로 A(-6) 와 맞은편의 T 와
상호작용한다. Trp149 및 Tyr151 는 포스페이트 주쇄 (backbone) 와 상호작용한다. 따라서 이들 4 개
의 잔기는 I-Scel 의 서열 특이성에서 중요해, 이들 4 개의 잔기 상에서 동시적인 포화 변이유발을 행하여 제 2
의 I-Scel 돌연변이 라이브러리를 만들었다.
이들 효소의 추가 공진화로 래트 IgM 엑손 II 및 III 내 타겟 서열 (CGTGGATCACAGGGGTCT 및
CTGGGATAACAGGAAGGA) 에 대해 특이적인 신규한 메가뉴클레아제를 생산한다.
정의된 서열 특이성을 가진 I-Cre 의 조작
신규한 타겟 서열에 대해 특이적인 귀소 엔도뉴클레아제의 조작에 있어서, 본 출원인은 효소 DNA 절단물을 살아
있는 숙주 세포와 결합하는 귀소 엔도뉴클레아제의 유도된 진화를 위해 매우 민감한 선택을 이용했다 (Chen 및
Zhao 의 문헌 "Nucleic Acid Research 33(18):e154, 2005 "에 자세히 기술됨). 게다가, 정의된 서열 특이
성을 가진 I-Crel 돌연변이를 조작하기 위한 일반적인 전략을 고안했다. I-Crel 은 모조의 팔린드롬 방식의
타겟 서열을 인지한다. 팔린드롬의 염기는 I-Crel 이 직접 인지하며, 변경되기 어려울 수 있다 (J. Mol.
Biol., 280, 345- 353) (도 4).
이러한 특성은 비(非)팔린드롬 서열을 인지하는 I-Crel 유도체의 직접 조작을 방해한다. 이러한 문제를 극
복하기 위해, 타겟 서열을 왼쪽으로 절반 (상류로 절반) 및 오른쪽으로 절반 (하류로 절반) 나누었다. I-
Crel 을 왼쪽으로 절반인 팔린드롬 및 오른쪽으로 절반인 팔린드롬 각각의 중간체 서열에 대해 최적화한다. (도
4). 이때, 중간체 서열에 대해 최적화된 I-Crel 돌연변이를 타겟 서열 팔린드롬을 인지하도록 조작한다.
종국에는, 왼쪽 절반에 대해 최적화되고 오른쪽 절반으로 최적화된 각각의 I-Crel 돌연변이가 공동-발현되어
타겟 서열을 절단할 것이다. 게다가, 왼쪽 절반이 최적화된 돌연변이와 오른쪽 절반이 최적화된 돌연변이의
폴리펩티드 링커에 의한 융합이 조사된다.
귀소 엔도뉴클레아제 I-Crel 의 천연 인지 서열과, 59% 의 서열 상동성을 공유하는 엑손 IV 내 타겟 서열
(CAACTGATCCTGAGGGAGTCGG) 을 동정했다. 후속해서, 본래의 ICrel 타겟 서열 내 팔린드롬 염기의 상동성을
기준으로, 2 개의 서열인 T5 및 T6 를 I-Crel 조작을 위한 타겟 서열로서 선택했다.
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I-Crel 인지 서열 및 2 개의 타겟 서열:
2 개의 타겟 서열인 T5 및 T6 을 리포터 플라스미드 내로 클로닝했다. I-Crel 유전자를 pTrc 플라스미드 내
로 클로닝하고 서열화하여, PCR 증폭 동안 어떠한 돌연변이도 도입되지 않았다는 점을 확인했다. I-Crel 선
택 시스템으로 세포 생존률에 대해 평가한다.
또한, 분자 모형화를 수행하고, DNA 기질에 직접 접촉하는 단백질 잔기를 동정했다. 또한, 본 출원인은 시
험관 내 공동-진화 실험을 위한 중간체 서열을 고안했다.
포화 변이유발을 위한 타겟 서열
후속해서, ICrel 돌연변이의 라이브러리를 생산하고, 신규한 타겟 서열을 가진 ICrel 유도체에 대해서 스크리닝
했다. 이들 효소의 추가 공진화로 래트 IgM 의 엑손 IV 내 타겟 서열 (CAACTGATCCTGAGGGAGTCGG) 에 대해
특이적인 신규한 메가뉴클레아제를 생산한다.
징크-핑거 뉴클레아제의 공법
징크-핑거 단백질 (ZFP) 을 래트 IgM (엑손 1-4) 를 인코딩하는 서열에 대하여 고안하고, 하기에 기술된 바와
같이 어셈블링하여 (assembling), 하기 ZFP 부분을 수득했다: Zhang, L. et al. Synthetic zing finger
transcription factor action at an endogenous chromosomal site, Activation of the human erythropoietin
gene. J. Biol. Chem 275:33850-33860, 2000, 및 Liu, P. Q. et al. Regulation of an endogenous locus
against a panel of designed zinc finger proteins targeted to accessible chromatin regions. Activation
of vascular endothelial growth factor. J Biol. Chem. 2765:11323-11334, 2001).
ZFP 를 인코딩하는 DNA 를 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 래트 C6 세포를 American Type Culture
Collection 로부터 입수하고, 권고되는 대로 5% 적격 송아지 태아 혈청 (FCS, Hyclone), 15% 말혈청
(Invitrogen) 및 5mM 글루타민으로 보충된 F-12 배지 (Invitrogen) 에서 키웠다. 세포를 TrypLE Select 프
로테아제 (Invitrogen) 를 이용하여 플라스틱제품에서 분리했다. 트랜스펙션을 위해, 200,000 C6 세포를
400ng 플라스미드 DNA 및 20μL Amaxa Solution SF 와 혼합했다. 세포를 Amaxa Nucleofector II Shuttle
에서 프로그램 96 FF-137 을 이용해 트랜스펙션시킨 다음 0.1 L 의 따뜻한 보충된 F-12 배지로 회수하였다.
트랜스팩션 후 3 및 9 일에, 세포를 수집하고 염색체 DNA 를 Quick Extract Soultion 1.0 (Epicentre) 를 이
용해 생산하였다. IgM 유전자자리의 적절한 영역을 Accuprime High-fidelity DNA 폴리머라아제
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(Invitrogen) 를 이용해 PCR 증폭했다. PCR 반응물을 94°로 가열한 다음, 서서히 실온으로 냉각시켰다.
약 200ng 의 어닐링된 DNA 를 0.33μL CEL-I 효소 (Transgenomic) 와 혼합하고, 20 분 동안 42°에서 인큐
베이션했다. 반응 생산물을 1X Tris-borate-EDTA 버퍼 중 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석했다.
절단 활성을 입증하는 전형적인 예를 도 6 에 나타낸다.
메가뉴클레아제를 인코딩하는 발현 플라스미드를 이용한 불활성화된 내생적 중쇄 유전자자리가 있는 래트의 생
산
래트 Cμ엑손에 대해 특이적인 메가뉴클레아제를 인코딩하는 cDNA 서열을, 테트라사이클린 오퍼레이터 서열에
의해 발현이 조절되는 발현 벡터 내로 클로닝한다. 플라스미드 DNA 를 제한 효소 소화로 선형화하고 정제한
다. 래트 난모세포를, 테트라사이클린-반응성 역 트랜스활성자를 인코딩하는 도입유전자를 가진 래트 유래
의 정자와 수정시킨다. 정제된 플라스미드 DNA 를 상기 수정된 래트 난모세포의 전핵에 주입한다. 이어
서, 래트 배아를 양엄마에게 이동시키고 분만시켰다. 신생아를 조직 샘플에서 단리된 DNA 를 이용하는 PCR
로써 메가뉴클레아제-인코딩 도입유전자의 존재에 대해 분석했다. 수컷의 트랜스제닉 시조 동물이 성적 성
숙기에 도달했을 때, 이들을 4 달 동안 가두어 둔다. 트랜스제닉 동물 내 메가뉴클레아제의 발현을, 1 내지
7 일 동안 독시사이클린을 매일 투여하여 유도한다. 후속해서, 정자를 일주일에 2 회 수집하여 PCR 로 분석
한다. 돌연변이 정자를 생산하는 수컷의 동물을 번식에 이용한다. 돌연변이된 래트 Cμ 를 가진
자손을, 조직 샘플의 PCR 분석으로 동정한다.
특이적인 메가뉴클레아제를 인코딩하는 플라스미드 DNA 를 가진 수정된 난모세포의 미세주입에 의한 불활성화된
내생적 중쇄 유전자자리를 가진 래트의 생산.
래트 Cμ 엑손에 특이적인 메가뉴클레아제를 인코딩하는 cDNA 서열을, CAG-프로모터에 의해 발현이 조절되는 발
현 벡터 내에 클로닝한다. 정제된 플라스미드 DNA 를 수정된 래트 난모세포의 전핵에 주입한다. 후속해
서, 래트 배아를 양모에게 이동시키고, 분만시킨다. 신생아를 PCR 및 직접 서열화에 의해 돌연변이된 IgM
엑손 존재에 대해 분석한다. 대안적으로, 돌연변이된 IgM 엑손을 가진 세포를 함유하는 동물을, CEL-I 효소
함유 가열 및 냉각 PCR 생산물의 인큐베이션 다음 겔 전기영동으로 동정한다.
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도면
도면1
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