면역요법을 위한 화학요법 약물 저항성 T―세포들의 조작 방법(METHOD OF ENGINEERING CHEMOTHERAPY DRUG RESISTANT T-CELLS FOR IMMUNOTHERAPY)

(19) 대한민국특허청(KR)
(12) 공개특허공보(A)
(11) 공개번호 10-2016-0103002
(43) 공개일자 2016년08월31일
(51) 국제특허분류(Int. Cl.)
C12N 5/0783 (2010.01) A61K 35/17 (2014.01)
A61K 45/06 (2006.01) G01N 33/50 (2006.01)
(52) CPC특허분류
C12N 5/0636 (2013.01)
A61K 35/17 (2013.01)
(21) 출원번호 10-2016-7016611
(22) 출원일자(국제) 2014년11월21일
심사청구일자 없음
(85) 번역문제출일자 2016년06월21일
(86) 국제출원번호 PCT/EP2014/075317
(87) 국제공개번호 WO 2015/075195
국제공개일자 2015년05월28일
(30) 우선권주장
61/907,874 2013년11월22일 미국(US)
PA201470362 2014년06월17일 덴마크(DK)
(71) 출원인
셀렉티스
프랑스, 에프-75013 파리, 뤼 드 라 크로아 재리
8
(72) 발명자
발통, 쥘리앙
미국, 뉴욕주 10028, 뉴욕, 533 12번가
뒤샤토, 필리프
프랑스, 에프-91210 드라베일, 케 데 담스, 바토
파웬
수르디브, 다비드
프랑스, 에프-92300 르발루아-페레, 뤼 루이스 미
셸 19
(74) 대리인
특허법인 대아
전체 청구항 수 : 총 32 항
(54) 발명의 명칭 면역요법을 위한 화학요법 약물 저항성 Ｔ―세포들의 조작 방법
(57) 요 약
본 발명은 암을 가진 환자를 치료하기 위하여 화학요법과 함께 면역요법을 위한 "기성품인" 동종이형
(allogeneic) 치료적 세포들의 사용에 대한 것이다. 특히, 본 발명자들은 화학치료 제제들에 저항성인 동종이형
(allogeneic) T-세포를 조작하는 방법을 개발한다. 이 전략에 의하여 제공되는 치료적 이점들은 화학요법 및 면
역요법 사이의 시너지 효과들에 의하여 증강된다. 특히, 본 발명은 T-세포 수용체 구성요소를 코드하는 적어도
하나의 유전자를 불활성화시키는 것에 의한, 그리고 상기 T-세포들을 변형시켜 약물 저항성을 부여하는 것에 의
한 T-세포들의 변형 방법에 대한 것이다. 본 발명은 암을 치료하기 위한 안정적이고 알맞은 입양 면역요법 전략
들에 대한 길을 연다.
대 표 도 - 도1
공개특허 10-2016-0103002
- 1 -
(52) CPC특허분류
A61K 45/06 (2013.01)
C12Y 207/01074 (2013.01)
G01N 33/5014 (2013.01)
A61K 2300/00 (2013.01)
C12N 2510/00 (2013.01)
공개특허 10-2016-0103002
- 2 -
명 세 서
청구범위
청구항 1
하기의 단계를 포함하는, 퓨린 유사체 약물에 저항성인 엑스(ex)-비보(vivo) 면역 세포들을 생산하는 방법:
(a) 면역 세포를 제공하는 단계;
(b) 디옥시사이티딘(deoxycytidine) 키나제 활성을 갖는 효소를 발현시키는 유전자를 특이적으로 타겟팅하는 희
귀-절단 엔도뉴클레아제를 코드하는 핵산 서열로 상기 면역 세포를 형질감여(transfect)시키는 단계 (dcK-EC
2.7.1.74);
(c) 상기 엔도뉴클레아제를 상기 면역 세포들 내로 발현시켜 상기 dcK 유전자의 타겟된 불활성화를 얻는 단계;
d) 단계 c)에서 얻어진 조작된 면역 세포들을 선택적으로 상기 퓨린 유사체 약물의 존재 하 확장시키는 단계.
청구항 2
제 1항에 있어서,
상기 면역 세포들은 T-세포들인 방법.
청구항 3
제 2항에 있어서,
상기 면역 세포들은 CD8 세포들인 방법.
청구항 4
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역 세포들은 TIL (종양(Tumor) 침윤(Infiltrating) 세포들(Cells))인 방법.
청구항 5
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역 세포들은 암으로 진단된 환자로부터 비롯되는 방법.
청구항 6
제 5항에 있어서,
추가의 단계 e)로 상기 환자 내로 상기 면역 세포들이 주입(inject)되는 방법.
청구항 7
제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나에 있어서,
공개특허 10-2016-0103002
- 3 -
상기 면역 세포들은 기증자로부터 비롯되는 방법.
청구항 8
제 2항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역 세포들은 TCR알파 또는 TCR베타를 코드하는 그것들의 유전자에서 더 불활성화시켜, 그것들을 동종이
형으로 만드는 방법.
청구항 9
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 희귀-절단 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제인 방법.
청구항 10
제 9항에 있어서,
TALE-뉴클레아제들 dCK 유전자 불활성화는 서열번호 63 또는 서열번호 64의 TALE-뉴클레아제들을 이용함으로써
수행되고, dCK 타겟 서열은 서열번호 62인 방법.
청구항 11
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 e)에서 상기 조작된 세포들은 인(in)-비보(vivo)에서 확장되는 방법.
청구항 12
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조작된 세포들은 인-비트로(vitro)에서 확장되는 방법.
청구항 13
제 2항에 있어서,
키메라 항원 수용체를 T-세포에서 발현시키는 단계를 더 포함하는 방법.
청구항 14
제 13항에 있어서,
상기 키메라 항원 수용체는 CD19 또는 CD123 인 방법.
청구항 15
제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
공개특허 10-2016-0103002
- 4 -
면역-체크포인트 유전자를 불활성화시키는 단계를 포함하는 방법.
청구항 16
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 퓨린 유사체 약물은 클로파라빈(clofarabine) 또는 플루다라빈(fludarabine)인 방법.
청구항 17
퓨린 유사체 약물에 저항성인, 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의하여 수득가능한 분리된 면
역 세포.
청구항 18
T-세포 수용체 구성요소(component)를 코드하는 적어도 하나의 방해된(disrupted) 유전자를 포함하는, 퓨린 유
사체에 저항성인 분리된 T-세포.
청구항 19
항원에 특이적인 키메라 항원 수용체 (CAR)가 부여되는, 퓨린 유사체에 저항성인 분리된 T-세포.
청구항 20
제 19항에 있어서,
상기 CAR는 CD19 세포들 또는 CD123 세포들을 타겟으로 하는 분리된 T-세포.
청구항 21
제 17항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
의약으로서 그것의 사용을 위한 분리된 T-세포.
청구항 22
제 20항에 있어서,
퓨린 유사체 약물의 사용과 결합인, 분리된 T-세포.
청구항 23
제 20항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서,
암 치료로서 그것의 사용을 위한, 분리된 T-세포.
청구항 24
공개특허 10-2016-0103002
- 5 -
제 23항에 있어서,
상기 암은 급성(acute) 림프모세포성(lymphoblasic) 백혈병(leukemia) (ALL) 또는 근위축(amyotrophic) 골수종
(myeloma) 백혈병(leukemia)인 분리된 T-세포.
청구항 25
제 17항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 분리된 T-세포를 포함하는 약학적 조성물.
청구항 26
하기를 포함하는, 그것을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법:
(a) 제 17항 내지 제 24항 중 어느 하나의 방법에 따른 T-세포들의 군집을 준비하는 단계;
(b) 상기 환자에게 상기 형질전환된 T-세포들을 투여하는 단계.
청구항 27
제 26항에 있어서,
퓨린 유사체 약물의 투여와 결합하는 단계를 더 포함하는, 환자를 치료하는 방법.
청구항 28
하기를 포함하는, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현시키는 상기 분리된 CAR T 세포 및 적어도 특정 표면 항원
(및 선택적으로 루시페라제와 같은 마커 유전자)를 발현시키는 타겟 세포들 둘 다, 약물 저항성 타겟 세포들 상
에 제 13항 또는 제 14항에 따른 분리된 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포들의 세포독성을 시험하는 방법;
(a) 타겟 세포들 및 T-세포들의 상기 군집 둘다를 준비하는 단계;
(b) 적어도 상기 특이적 타겟 세포들로 상기 T-세포들 군집을 배양하는 단계;
(c) 상기 특이적 타겟 세포들의 생존능 비율(rate)을 결정하는 단계.
청구항 29
제 28항에 있어서,
상기 저항성 유전자는 dCK인 방법.
청구항 30
제 28항 또는 제 29항에 있어서,
상기 표면 항원은 CD19인 방법.
청구항 31
제 30항에 있어서,
공개특허 10-2016-0103002
- 6 -
상기 타겟은 CD19 푸시페라제(Luciferase) 다우디(Daudi) 세포들인 방법.
청구항 32
하기를 포함하는, 타겟 세포에 대한 CAR T 세포의 세포독성 시험 방법을 수행하기 위한 키트:
(a) 항원에 대한 CAR 특이적이 부여된 상기 T 세포 군집;
(b) 상기 항원을 발현시키는 상기 타겟 세포들;
(c) 선택적으로 배양 배지;
본 발명에 따른 화학요법 약물들에 저항성으로 만들어진 T 세포들 및 타겟 세포들 둘다.
발명의 설명
기 술 분 야
본 발명은 암환자들을 치료하기 위하여, 화학요법(chemotherapy)과 함께 면역요법(immunotherapy)을 위한 "기성[0001]
품인(off-the-shelf)" 동종이형(allogeneic) 치료적 세포들의 이용에 대한 것이다. 특히 본 발명자들은 화학요
법제들(chemotherapeutic agents)에 저항성인 동종이형 T-세포들을 조작하는 방법을 개발하였다. 이 전략에 의
하여 제공되는(afforded) 치료적 이점들은 화학요법 및 면역요법 사이의 시너지 효과들에 의하여 증강된다. 특
히, 본 발명은 T-세포 수용체(receptor) 요소(component)를 코드하는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시킴으로
써 그리고 상기 T-세포들을 약물 저항성을 부여하도록 변형함으로써 T-세포들을 변형하는 방법에 대한 것이다.
본 발명은 암을 치료하기 위한, 표준 및 알맞은(affordable) 입양(adoptive) 면역요법 전략들로의 길을 연다.
[0002]
배 경 기 술
엑스 비보(ex vivo)에서 만들어내는 자기유래(autologous) 항원-특이적 T-세포들의 전달(transfer)을 수반하는[0003]
입양 면역요법은 암을 치료하는 유망한 전략이다. 입양 면역요법에 사용되는 T-세포들은 유전공학을 통하여 T-
세포들의 방향수정(redirection) 또는 항원-특이적 T 세포들의 확장에 의하여 만들어질 수 있다(Park,
Rosenberg et al. 2011). 바이러스 항원 특이적 T-세포들의 전달(transfer)은 희귀한 바이러스-관련 악성종양들
(malignancies) 및 이식 관련 바이러스 감염들의 치료에 사용되는 잘-확립된 절차이다. 유사하게 종양(tumor)
특이적 T-세포들의 분리 및 전달은 흑색종(melanoma)를 치료하는데 성공적인 것으로 보여져 왔다. T-세포들에서
신규한 특이성들이 키메라(chimeric) 항원(antigen) 수용체들(receptors) (CARs) 또는 형질전환(transgenic) T
세포 수용체들의 유전적 전달을 통하여 성공적으로 발성되어 왔다. CAR들(CARs)은 단일 융합 분자 내 하나 또는
그보다 많은 신호전달(signaling) 도메인들(domains)과 관련된 타겟팅(targeting) 모이어티(moiety)로 구성되
는 합성 수용체들이다. CAR들은 림프종들(lymphoma) 및 고형암들(solid tumors)을 포함하는 여러가지 악성종양
들(malignancies)로부터 암 세포들의 표면에 발현되는 항원들에 대항하여 T-세포들이 방향을 수정하도록
(redirect) 성공적으로 허용하여 왔다 (Jena, Dotti et al. 2010).
입양 면역요법을 이용하는 환자의 치료를 위한 현재의 프로토콜은 자기유래(autologous) 세포 전달에 기초한다.[0004]
이 접근에서, T 림프구들(lymphocytes)이 환자들에게서 회수되고, 엑스 비보에서 선택되거나 유전적으로 변형되
고, 필요하다면 세포들의 수를 증폭시키기 위하여 인 비트로(in vitro)에서 배양되고 최종적으로 환자 내로 주
입(infuse)된다. 자기유래(autologous) 요법들은 실제 적용에 상당한 기술적 및 논리적(logistic) 장애물들을
직면하는데, 그것들의 발생은 비싼 전용 시설들 및 전문 인력들을 요구하고, 그것들은 환자의 진단 후 빠른 시
간 내에 만들어져야 하고, 많은 경우, 환자의 사전처리(pretreatment)는 저하된(degraded) 면역 기능을 야기하
여, 환자의 림프구들이 저조하게 작용하고, 매우 적은 수로 존재할 수 있다. 이러한 장애물들 때문에, 각 환자
의 자기유래(autologous) 세포 제제는 효과적으로 새로운 상품이며, 약효 및 안정성에서 상당한 차이를 야기한
다.
이상적으로, 동종이형(allogeneic) 치료적 세포들이, 상세하게 특징되어, 미리 제조되고, 환자들에게 즉시 투여[0005]
되도록 이용 가능한 표준화된 요법을 사용하고 싶어한다. 그러나 동종이형(allogeneic) T-세포들은 같은 종에
공개특허 10-2016-0103002
- 7 -
속하지만 유전적으로 다른 개인들로부터 수득된다. 그러므로 동종이형(allogeneic) 세포들 내인성(endogenous)
TCR 특이성들은 숙주 조직을 외래(foreign)로 인식하여, 이식편대숙주병(graft versus host disease) (GvHD)을
야기하는데, 이는 심각한 조직 손상 및 죽음을 야기할 수 있다. T 세포(cell) 수용체들(receptors) (TCR)은 항
원의 제시에 답하여 T 세포들의 활성화에 참여하는 세포 표면 수용체들이다. 면역글로불린(immunoglobulin) 분
자들을 위하여, 알파 및 베타 체인들의 가변(variable) 영역(region)은 V(D)J 재조합(recombination)에 의하여
만들어지고, T 세포들 군집(population) 내 항원 특이성들의 큰 다양성을 만든다. 그러나, 온전한 항원을 인식
하는 면역 글로불린들과는 대조적으로, T 세포들은, MHC 제한(restriction)으로 알려진 T 세포들에 의한 항원
인식에 여분의 차원(extra dimension)을 도입하는, MHC 분자와 관련된 가공된(processed) 펩타이드 단편들에 의
하여 활성화된다. T 세포 수용체를 통한 기증자(donor) 및 수혜자(recipient) 사이의 MHC 차이들(disparitie
s)의 인식은 T 세포들 증식 및 GVHD의 잠재적 발달로 이어진다. 동종이형(allogeneic) 세포들을 효과적으로 이
용하기 위하여, 본 발명자들은 TCR알파(TCRalpha)또는 TCR베타(TCRbeta) 유전자를 불활성화시키는데, 이는 T-세
포들의 표면으로부터 TCR의 제거를 야기하고 이렇게 하여 동종항원(alloantigen)의 인식 및 이렇게 GVHD을 방지
한다.
암 발견(detection) 및 종양 세포 생물학의 영역에서 뛰어난 진보가 이루어져왔음에도 불구하고, 말기 및 전이[0006]
성 암의 치료는 주된 도전으로 남아 있다. 세포독성 화학요법 제제는 가장 널리 사용되고 성공적으로 이용되는
항암 치료들 중에 있다. 항대사물질들(anti-metabolites), 알킬화제들(alkylating agents), 안트라사이클린들
(anthracyclines), DNA 메틸트렌스페라제(methyltransferase) 억제제들, 백금 화합물들(platinum compounds)
및 방추체 독들(spindle poisons)과 같은 몇몇 세포독성 제제(agents)들이 암세포들을 죽이기 위하여 개발되어
왔다. 그러나, 그것들은 균일하게 효과적이지 않고, 면역요법들과 같은 신규 요법들에 이들 제제들의 도입은 문
제가 많다. 예를 들어, 화학요법 제제들은, 제제들의 비특이적 독성(toxicity) 프로파일들(profiles) 때문에,
탄탄한 항종양 면역적격(immunocompetent) 세포들의 확립에 해로울 수 있다. 세포 증식 경로들을 타겟팅하는 작
은 분자-에 기초한 요법들은 또한 항종양 면역력(immunity)의 확립을 방해할 수 있다. 그러나, 만약 일시적으로
효과적인 화학요법 양생법(regimen)이 신규 면역적격(immunocompetent) 세포 요법들과 결합할 수 있으면, 그 다
음에 항-신생(neoplastic) 요법에서 중요한 개선이 달성될 수 있다(리뷰를 위하여 (Dasgupta, McCarty et al.
2011)).
이런 식으로, 화학요법과 함께 "기성품인(off-the-shelf)" 동종이형(allogeneic) 치료적 세포들을 이용하기 위[0007]
하여, 본 발명자들은 화학치료적 제제들에 저항성인 동종이형(allogeneic) T-세포를 조작하는 방법을 개발한다.
이 전략에 의하여 제공되는 치료적 이점들은 화학요법 및 면역요법 사이의 시너지 효과들에 의하여 증강될 것이
다. 게다가 약물 저항성은 또한 조작된 T-세포 요법을 선택적으로 확장하는 능력으로부터 이익을 얻을 수 있고,
이로써 이들 세포들로의 비효율적인 유전자 전달에 기인하는 문제들을 피한다.
도면의 간단한 설명
- 도 1은 퓨린(purine) 뉴클레오사이드(nucleoside) 유사체들(analogs) (PNAs)의 세포 독성 및 경로의 도식적[0008]
인 표시에 부합한다; 효소 디옥시사이티딘(deoxycytidine) 키나제 (dCK)의 불활성화는 약물들 클로파라빈
(clofarabine) 및 플루다라빈(fludarabine)에 대한 저항성을 부여한다;
- 도 2는 효소 하이포크산틴(hypoxanthine)-구아닌(guanine) 포스포리보실트랜스페라제
(phosphoribosyltransferase) (HPRT)가 약물들 6-머캅토퓨린(Mercaptopurine) (6MP) 및 6 티오(thio)-구아닌
(guanine) (6TG)에 대한 저항성을 부여하는 것을 보여준다;
- 도 3A는 엑손들 및 인트론들의 면에서 전체 dCK 유전자 건축을 묘사하고, 도 3B는 dCK 엑손 2에서 2 TALE-뉴
클레아제 TKd들에 위치한 TALE-뉴클레아제 타겟 자리들의 서열들을 보여준다;
- 도 4는 HPRT KO T 세포들을 만들고 특징화하는 것을 따르는 작업 흐름을 보여준다; D0은 일(Day) 0을 나타내
고, Dn은 일(Day) n을 나타내고 ; T7은 엔도 T7 분석에 대응한다;
- 도 5는 dCK 유전자의 가공을 체크하기 위한 엔도 T7 분석으로부터 얻어진 결과들을 나타낸다; 위쪽 밴드는 가
공되지 않은 WT dCK 유전자에 대응하고, 2 개의 아래쪽 밴드들은 가공된 dCK 유전자에 대응한다;
- 도 6은 전기천공 후 14 일의 기간 동안 WT T-세포들 대조군들 1 및 2 및 dCK2 TALE-뉴클레아제를 코드하는
mRNA 5 μg 또는 10 μg으로 처리된 dCK KO T-세포들의 세포 확장을 나타낸다.
- 도 7은 1 μM 클로파라빈(clofarabine) ( )의 존재 하 또는 클로파라빈(clofarabine) (-)의 부존재 하 (5 μ
공개특허 10-2016-0103002
- 8 -
g의 TALE-뉴클레아제 dCK 2 쌍을 이용함으로써) T 세포들에서 dCK 불활성화를 체크하기 위한 일(Day) 8 (D8)에
수행된 엔도 T7 분석을 나타낸다;
- 도 8은 증가하는 양의 클로파라빈(clofarabine) (10 nM 내지 10 μM)의 존재 하 2 일 동안 배양된 (dCK2
TALE-뉴클레아제 쌍을 코드하는 mRNA 5 μg 또는 10 μg으로 처리된) WT 및 dCK KO T 세포들의 세포 생존능의
퍼센트를 나타낸다. 이 그래프는 둘다 세포 군집들에 대한 클로파라빈(Clofarabine) IC50을 결정하도록 한다;
- 도 9는 클로파라빈(clofarabine) 저항성 동종이형(allogeneic) T 세포들을 만들고 특징화하는데 사용되는 2
개의 작업흐름들을 보여준다; 위쪽의 하나는 약물 선택이 수행되었을 때의 경우에 대응하고, 대조적으로 아래쪽
것은 약물 선택이 이루어지지 않았던 것이다; 일(Day) 0 (D0)는 TRAC 및 dCK TALE-뉴클레아제들에 의한 이중 전
기천공이 현실이 된(realized) 날이다;
- 도 10은 전기천공 후 다른 시기들(D1, D3 및 D6)에 T-세포들에서 이중 KO dCK/TRAC의 약효를 유전적으로 체크
하기 위한 엔도 T7 분석에 대응한다. 각각의 자리들에 대하여 사용된 프라이머들은 예에서 나타나 있으며, 단순
한(simple) KO dCK T-세포 ( -) 및 단순한 KO TRAC T-세포 (- ), 이중(double) KO dCK/TRAC T-세포들 ( ) 및
WT T 세포들 (--)이다; 아래쪽 밴드들은 정확한(correct) dCK 및 TRAC 유전자 가공(processing)을 의미한다;
- 도 11은 TRAC 불활성화와 같이 ( ) 또는 없이 (-), 클로파라빈(clofarabine)의 부존재 (-) 또는 존재 ( ) 하
dCK 불활성화의 약효를 체크하기 위한 딥 시퀀싱 데이터 및 엔도 T7 분석에 대응한다, 범례(legend)는 도 10보
다 동일하다; 삽입-결실(indel) 빈도는 dCK 자리에서 삽입들/결실들의 비율(rate)을 평가하기 위하여 수행되었
다;
- 도 12A는 항 TCR mAb-PE의 부존재 하 (표지되지 않은 T 세포들) 또는 존재 하 (표지된 T 세포들) T 세포들로
수행된 표지 대조군 실험을 나타낸다; 도 12B는 TRAC KO T 세포들 정제 전 및 후 클로파라빈의 존재 또는 부존
재 하 배양 후 수집된 TCAR 음성(negative) 세포들을 모니터하는 것이다. 이들 세포들은 또한 dCK 유전자에 대
하여 불활성화되었다;
- 도 13은 전기천공 후 12일의 기간 동안 클로파라빈의 부존재 하 WT T-세포들 대(versus) 이중 KO dCK/TRAC T
세포들 및 단순한 KO dCK 및 TRAC T-세포들의 성장 속도를 보여준다;
- 도 14는 11일의 기간 동안 (클로파라빈과 같이 또는 없이) CAR T 세포들에 비교하여 다른 클로파라빈
(clofarabine) 투여량들(doses)(0.1 부터 10 μM까지)를 갖는 배지들에서 dCK/TCAR 이중 KO CAR T-세포들의 성
장 속도 곡선(cuves)들을 보여준다;
- 도 15는 다른 클로파라빈(clofarabine) 투여량들(doses) (1 nM 부터 100 μM까지)을 갖는 배지들에서 WT T-
세포들 대(versus) 단순한 KO dCK 또는 TRAC T 세포들, 이중 KO dCK/TCAR T-세포들에 대한 세포 생존능의 퍼센
트를 보여준다; 이 그래프는 각각의 T 세포들 군집 상 클로파라빈에 대한 IC50의 결정을 하게 한다;
- 도 16은 WT T 세포들 (KO 없음 그리고 CAR 없음) 및 이중 KO TRAC/dCK T 세포들 (CAR 없음, 그러므로 CD19
항원을 발현시키지 않음) 대(versus) CAR FMC63 T 세포들에 비교한 이중 KO TRAC/dCK CAR T 세포들 (둘다 CD19
항원을 발현시킴)에 대한 특이적 세포독성의 퍼센트를 나타낸다;
- 도 17은, 이들 T-세포들이 증가하는 투여량들(doses)의 클로파라빈(clofarabine) (10 ng 내지 100μg, 위쪽
그래프), 및 플루다라빈(fludarabine) (10 μM 내지 100 μM, 아래쪽 그래프)에서 배양될 때, CAR T-세포들 대
조군 대(versus) 이중 KO dCK/TCAR CAR T-세포들에 대한 세포 생존능을 보여준다. 이들 그래프들은 두 약물들
클로파라빈(clofarabine) 및 플루다라빈(fludarabine)에 대한 IC50의 결정을 하게 한다;
- 도 18은 WT 세포들 (-) 대(versus) (5 μg의 dCK TALE-뉴클레아제을 코드하는 mRNA가 사용된) 다우디(Daudi)
세포들 ( )에서 dCK 불활성화의 약효를 유전적으로 체크하기 위하여, 일(Day) 2 (D2)에서의 엔도 T7 분석에 대
응한다. 위쪽의 밴드는 가공되지 않은 dCK 유전자에 대응하는 반면, 2 개의 아래쪽 밴드들은 dCK 불활성화의 산
물들에 대한 것이다;
- 도 19는 증가하는 야의 클로파라빈(clofarabine) (0.1 내지 1 μM)의 존재 또는 부존재 하 WT 다우디(Daudi)
세포들 대(versus) KO dCK 다우디(Daudi) 세포들의 7일의 기간 동안 (x10
6
세포들로 발현된) 성장 속도를 나타
낸다;
- 도 20은 다른 TALE-뉴클레아제 타겟 자리들(그것들 모두는 엑손 2에 있음)의 위치 및 엑손들 및 인트론들)의
공개특허 10-2016-0103002
- 9 -
면에서 전체 HPRT 유전자 건축을 보여준다;
- 도 21은 HPRT KO T 세포들을 만들고 특징화하는데 사용되는 작업흐름을 묘사한다;
- 도 22는 일(Day) 4 (D4), TALE-뉴클레아제 HPRT 쌍들 번호(n°) 1 및 T 쌍 번호(n°) 2에 의하여 T 세포들에
서 HPRT 유전자 불활성화를 체크하기 위한 엔도 T7 분석을 나타낸다(2 투여량들(doses)이 시험되었다; 5 μg 및
10 μg);
- 도 23은 WT T 세포들 대조군 1 및 대조군 2 대(versus), 5 또는 10 μg의 TALE-뉴클레아제 HPRT 1 쌍(pair)
(HPRT1) 또는 TALE-뉴클레아제 HPRT 2 쌍(pair) (HPRT2)를 이용하여, KO HPRT T 세포들의 13일의 기간 동안
(x10
6
세포들로 발현된) 성장 속도를 나타낸다;
- 도 24는 이들 T-세포들이 1 μM의 약물 6TG에서 배양될 때, D8 및 D18에서 [파(par) (-)로 상징된] WT T 세
포들 대(versus), 5 또는 10 μg TALE-뉴클레아제 HPRT 쌍들 번호(n°) 1 (TALE-뉴클레아제 HPRT 1)을 이용한,
T 세포들에서 HPRT 유전자 불활성화를 체크하기 위한 엔도 T7 분석을 나타낸다;
- 도 25는 4G7 CAR의 존재 또는 부존재 하 T 세포들에서 HPRT 유전자 불활성화를 체크하기 위한 엔도 T7 분석을
나타낸다, 이 분석은 6TG 선택 없이 수행되었다;
- 도 26은 WT T 세포들 (KO 없음 그리고 CAR 없음) 및 CAR 4G7 T 세포들에 비교한 KO HPRT CAR T 세포들에 대
한 특이적 세포독성 (둘다 CD19 항원을 발현시킴)의 퍼센트를 보여준다;
- 도 27은 증가하는 투여량들(doses)의 6TG 약물에서 (10 ng 내지 50 μM) WT T 세포들 대(versus) KO HPRT
CAR T-세포들에 대한 세포 생존능의 퍼센트를 보여준다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
본 발명의 개요[0009]
한 측면에서, 본 발명은 면역 세포들의 조작 방법들을 제공하는데, 이는 그것들을 클로파라빈(clorofarabine)[0010]
및 플루다라빈(fludarabine)과 같은 퓨린(purine) 뉴클레오타이드(nucleotide) 유사체들(analogs) (PNA)과 같
은 화학요법 약물들에 저항성으로 만들어, 그것들을 현재의 화학요법들로 사전처리된 환자들에서 암 면역요법
치료들에 사용될 수 있게 한다. 면역(immune) 세포들은 자기유래(autologous) 치료들을 수행하는 것을
고려하여, TIL (Tumor Infiltrating Lymphocytes)의 경우와 같이 환자로부터 또는 동종이형(allogeneic) 치료
들에서 사용될 수 있는, 동종이형(allogeneic) 세포들을 생산하는 것을 고려하여 기증자로부터 유래할 수 있다.
후자의 경우에서, 면역 세포들이 T-세포들일 때, 본 발명은 또한 화학요법 약물들에 저항성이고 동종이형 둘 다[0011]
로 만들어진 T-세포들을 조작하는 방법들을 제공한다. 이러한 방법들은 dcK 및 HPRT 유전자들과 같은 약물 민감
성(sensitizing) 유전자의 불활성화에 더하여, T-세포(T-Cell) 수용체(Receptor) (TCR) 요소, 특히 TCR알파,
TCR베타 유전자들을 코드하는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시키는 단계를 포함한다.
또다른 측면에 따라, 약물 저항성 유전자을 발현함으로써 T-세포에 약물들에 대한 저항성이 부여될 수 있다. 디[0012]
하이드로폴레이트(dihydrofolate) 리덕타제(reductase) (DHFR), 이노신(inosine) 모노포스페이트
(monophosphate) 다히아드로게나제(dehydrogenase) 2 (IMPDH2), 칼시뉴린(calcineurin) 또는 메틸구아닌
(methylguanine) 트랜스페라제(transferase) (MGMT)와 같은 몇몇 유전자들의 여러가지 대립형질들(alleles)이
본 발명에 따른 세포에 약물 저항성을 부여하는 것으로 확인되어 왔다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의하여 수득가능한 분리된 세포들 또는 세포주들, 더욱 특히 여기에 기재된 단백질[0013]
들, 폴리펩타이드들, 대립(allelic) 변이체들(variants), 변화된(altered) 또는 결실된 유전자들 또는 벡터들을
포함하는 분리된 면역 세포들을 포함한다.
[0014]
본 발명의 면역 세포들 또는 세포주들은 외인성(exogenous) 재조합 폴리뉴클레오타이드들, 특히 CAR들 또는 자[0015]
살 유전자들을 더 포함할 수 있고, 또는 그것들은 이상적으로 "기성품인(off the shelf)" 산물로서, 치료적 산
물로서 그것들의 효율에 공헌하는 체크포인트 단백질들 또는 그것의 리간드들을 코드하는 변화된 또는 결실된
유전자들을 포함할 수 있다. 또다른 측면에서, 본 발명은 상기 방법들에 의하여 수득가능한 조작된 면역 세포를
투여함으로써 환자에서 암을 치료 또는 예방하는 방법에 대한 것이다.
공개특허 10-2016-0103002
- 10 -
본 발명의 자세한 기술[0016]
여기에서 특별히 정의되지 않는 한, 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 유전자 요법, 생화학, 유전학 및[0017]
분자 생물학의 영역에서 당업자에 의하여 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
여기에서 기재된 것들과 유사하거나 또는 등가인 모든 방법들 및 물질들은, 여기에서 기재된 적절한 방법들 및[0018]
물질들과 함께, 본 발명의 시험 또는 실행에 사용될 수 있다. 여기에서 언급된 모든 공개들, 특허 출원들, 특허
들 및 다른 참고문헌들은 그 전체가 참고로서 포함된다. 충돌의 경우에, 정의들을 포함하는 본 명세서가 우선된
다. 나아가, 물질들, 방법들 및 예들은 설명을 위한 것일 뿐이며, 다르게 특정되지 않는한, 제한하는 것으로 의
도되지 않는다.
본 발명의 실행은, 다르게 표시되지 않는 한, 기술(art)의 기술(skill) 내인 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생[0019]
물학, 유전자이식(transgenic) 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 현재의 기술들(techniques)을 이용
할 것이다. 이러한 기술(techniques)들은 문헌에서 완전히 설명된다. 예를 들어, Current Protocols in
Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold
Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S.
Pat. No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries